基因操作课件

基因操作

GenemanipulationAnoverviewofDNAcloningSomeconceptionneedtoknowSomeusefultechnologyforgenemanipulationEnzymesforDNAcloningVectors一、ConceptionDNA克隆：将目的基因连接到载体上，形成通常可以在另一宿主细胞内进行复制的重组DNA。带有重组DNA的宿主细胞的增殖构成了一群具有遗传一致性的个体，或称为克隆。这一系列操作过程就称为DNA克隆。亚克隆：将已克隆的DNA片段从一个载体转移到另一个载体的过程称为亚克隆。亚克隆可用来对较大的克隆片段上较短区断进行仔细研究；将基因转移到能在特定物种中表达的另一载体上；2、Subcloning(亚克隆)①含有目标克隆序列的质粒DNA的提取。②用限制性内切核酸酶将质粒酶切成不连续的片段③经琼脂糖凝胶电泳分离片段④纯化目标片段⑤将目标片段连接在新质粒载体上，形成新重组分子⑥将连接好的质粒转化某一大肠杆菌菌株⑦转化细菌的筛选⑧重组质粒的分析最常见的亚克隆程序:3、DNA文库DNA文库：一套DNA克隆，每个克隆都是插入了不同片段的载体在宿主中扩增后的产物。克隆：一个遗传上独立的个体或一群相同的个体。Hostorganism/cell:

wheretheplasmidsgetmultipliedandpropagatedfaithfully,whichiscrucialforDNAcloning.HostsforDNAcloningvector

Prokaryotichost:E.coli(mostcases) Eukaryotichost:Yeast(Saccharomycescerevisiae),largefragmentsofhumangenome4、Hostcell宿主细胞5、Vector（载体）在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体。

细菌表达载体酵母表达载体哺乳动物表达载体Typesofvector(载体的类型)(1)Cloningvector克隆载体：可以插入、保存外源DNA，并在DNA水平上进行操作大肠杆菌克隆载体：质粒、噬菌体(λ＆M13)、黏粒即质粒－噬菌体的杂合体细菌人工染色体（BAC）酵母克隆载体：酵母人工染色体（YAC）(2)Expressionvector表达载体：可使外源基因插入和表达。具有RNA转录所需的启动子和终止子。(3)Integrationvectors整合载体：允许外源DNA插入，并在转化后整合到宿主细胞基因组中。整合是通过质粒与受体细胞中同源序列间发生的同源重组介导的。细菌整合载体（根癌农杆菌Tｉ质粒可被用来将DNA整合到植物基因组中）酵母整合载体哺乳动物整合载体：病毒为基础（以病毒的天然感染为基础，可用于基因治疗、转基因动物等。）是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。

生物学特征：（1）分子量小：2～200kb，多个拷贝。（2）复制起点：自主复制；（3）编码基因少：其中有（抗生素抗性基因）

Plasmid(质粒)（4）质粒的空间构型：①共价闭合环状DNA（cccDNA)CovalentclosecircularDNA呈超螺旋（SC）（supercoil）②开环DNA（

opencircular，

ocDNA）一条链上有一至数个缺口。③线形DNA（linear，lDNA）

质粒载体的一般特征：①独立于宿主基因组的自主复制DNA；②易于从宿主细胞中分离出来；③至少包含一个选择标记，即一个能使含有该载体的宿主可以从不含该载体的细胞中筛选出来绝④含有多克隆位点MCS；⑤分子量小，拷贝数多。质粒的选择标记及其工作原理ampr基因编码β－内酰胺酶，降解青霉素类抗生素如氨苄青霉素。tetA基因编码一种跨膜泵蛋白，能从细胞内将四环素类抗生素排出。Kanr

编码氨基糖苷磷酸转移酶，对卡那霉素进行修饰，阻断其与核糖体结合作用。

二、Technology聚合酶链式反应（PCR技术）Plasmidpreparation（质粒的提取）Restrictiondigests（限制性酶切）Agarosegelelectrophoresis（琼脂糖凝胶电泳）DNAligation（连接）Transformation（转化）Selection（筛选）1985年，MullisK.发明了一种模拟天然DNA复制过程的核酸体外扩增技术;。

1988年，美国PE-cetus公司推出世界上第一台PCR热循环仪，从而使PCR反应自动化；1993年，Karymullis因发明PCR技术获得诺贝尔化学奖；1995年，定量PCR仪诞生，使定量研究DNA靶序列成为现实。TheNobelPrizeinChemistry1993PCR技术的诞生与发展

按照模板链的序列以互补的方式依次把dNTP加至引物的3´端，TaqDNA聚合酶使杂交双链不断延伸，直至形成新的DNA双链原理：在试管中，利用DNA聚合酶、一对引物和四种dNTP，对模板DNA反复多次地进行复制，从而得到大量扩增产物的反应过程。变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚CDNA双螺旋的氢键断裂，形成单链分子作为反应的模板引物与模板互补结合，形成杂交链Cycle355

555

5

555

5

55

555

525～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。N次循环后，得到2n条DNAPCR的基本反应步骤1、制备模板DNA2、PCR循环反应3、PCR产物的检测（1）电泳分离PCR产物（2）染色及检测样本来源：各种组织细胞、培养细胞、寄生虫、微生物、临床标本、犯罪现场标本、考古标本。2.Plasmidmini－preparationfromE.coli小量制备质粒DNA：①含质粒大肠杆菌细胞的培养；②离心菌液收集菌体沉淀；③碱裂解：悬浮细胞沉淀，碱裂解，中和；④酚抽提去除蛋白杂质；⑤乙醇沉淀核酸。如何提取自己的DNA?在悬浮缓冲液中重悬细胞；溶菌酶降解细菌细胞壁；裂解缓冲液中裂解细胞，裂解缓冲液含有SDS和NaOH,SDS的作用是破碎细胞膜及引起蛋白质变性。NaOH的作用是使DNA变性。中和：中和缓冲液含KOAc(pH5)，其作用是沉淀已变性的蛋白质和染色体DNA及大部分去污剂。超螺旋质粒DNA易复性；染色体DNA不能复性。碱裂解染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质—SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。

（1）原理：①溶菌酶能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的-1，4糖苷键。在碱性条件（pH>8）下有活性。②葡萄糖增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力（震荡）的作用而降解。③EDTAMg2+、Ca2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。④NaOH-SDSNaOH：强碱，提供pH>12的碱性条件，使DNA双链变性。SDS:溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白—SDS”复合物，使蛋白质（包括DNA酶）变性沉淀。（2）所用的试剂作用⑤NaAc-HAc缓冲液冰醋酸把醋酸钠溶液的pH调到5。用来中和NaOH变性液，使DNA复性。高浓度的NaAc有利于变性的大分子（蛋白质、DNA、RNA等）沉淀。⑥酚-氯仿

蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。但苯酚会残留在DNA溶液中。

（现多用各种商品化的层析柱纯化DNA)。⑦乙醇：用于沉淀DNA。

DNA分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去DNA分子的水环境。centrifugationpelletcellCsCLgradientpurification3、RestrictiondigestsIdentifiedinthe1960sandearly1970s

BacterialenzymeswhichcutDNAintodefinedandreproduciblefragmentsKeydiscoverywhichallowedtheDNAcloningtobecomeareality20世纪60年代和70年代初鉴定来自细菌，可将DNA酶切成特定的、可再生的片段。其发现及鉴定是实现DNA克隆的关键。Restrictionendonuclease限制性内切核酸酶：存在于细菌细胞中的一种识别一小段对称的DNA序列，在识别位点处切割（水解）双链DNA骨架的酶。识别序列：4～8bp的回文序列；特异性高：酶切产物：3’或5’突出末端或平头末端;新形成的5’-P,3’－OH。4、GelElectrophoresis带电荷的分子在电场中会以一定的速率向与其电荷性质相反的电极移动，速度称为电泳迁移率

电泳迁移率同电场的强度和分子本身所带的净电荷数目成正比。

电泳迁移率同分子与介质的摩擦系数成反比。

摩擦系数主要与分子的大小、形状以及介质的粘度有关。

如果电场强度一定（电压和电极距离）、电泳介质相同：

电泳的基本原理电泳迁移率主要取决于分子本身的大小和形状。形状相似的分子的迁移速度主要与分子量相关:分子量越大，移动越慢。琼脂糖凝胶电泳琼脂糖一种线性多糖聚合物，从红色海藻产物琼脂中提取而来。琼脂糖凝胶琼脂糖在水里（或电泳液）中加热到沸点后溶解，冷却后又凝固成均匀的的胶体“胨”。琼脂糖的浓度决定凝胶的空隙（密度）。浓度高空隙小琼脂糖凝胶的分辨力

Agrose:apolysaccharidederivedfromseaweed,whichformsasolidgelwhendissolvedinaqueoussolution(0.5%-3%)核酸在凝胶中向正极移动？核酸具有很强的负电性。①检测DNA②分离、纯化目的DNA片段③分析重组质粒应用凝胶染色染料

溴化乙锭

Ethidiumbromide（EB）原理

扁平分子，能插入DNA碱基之间，但不与琼脂糖结合。

EB在300nm紫外光照射下能发红色荧光，即可显示DNA泳带在凝胶中所处的位置

.荧光强度与DNA含量及大小成正比。

在有5’末端磷酸基团时，DNA连接酶可共价连接互补配对的黏性末端或平头末端。Ligase：由ATP水解提供能量，将dsDNA切口处5’－磷酸与3’－羟基相结合5、DNAligation6、Transformation感受态细胞(componentcell)：用Ca2+

溶液处理后易于吸收外源DNA的大肠杆菌细胞。用于制备感受态的大肠杆菌细胞是不能表达限制修饰系统的特定菌株。转化：感受态细胞吸收外源DNA（质粒）的过程。Transformantionefficiency:numberofanti-biotic-resistantcoloniesformed（onaselectplate）permicrogram(mg)ofinputplasmidDNA.Rangesfrom103/μgtomorethan108/μg.105/μgisadequateforasimplecloning.Heat-shock:AftertheDNAisuptaken,thecellsshallbeputat42oCfor1mininordertoinducethesuppressedenzymesforcelldefending，whichallowthecellstorecoverfromtheunusualconditionofthetransformationprogress,andincreasetheefficiency.转化效率：每毫升用于转化的质粒DNA在选择平板上所形成的具抗生素抗性的菌落数。转化率的变动幅度从粗放转化程序103/μg~精细转化程序108/μg。热激：42oC热激1~2分钟。诱导与DNA修复有关的酶及其它细胞成分的生成。有利于细胞从转化过程中的不正常状态下恢复过来，提高转化效率。7、selectionDistinguishbetweentherecreatedvectorandreligatedvectorisveryimportant.鉴别环化载体分子与重组质粒是分子克隆中非常重要的步骤。双抗生素抗性筛选蓝－白斑筛选TwinantibioticresistanceBlue-whitescreening-半乳糖苷酶Xgal显色反应

-半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。

lacZ编码β－半乳糖苷酶，受lac启动子的调控。当E.coli菌株表达Lac阻抑物时，则载体上的lacZ基因由IPTG诱导表达，表达形成的酶可利用底物X-gal一种形成蓝色化合物。重组质粒中lacZ的插入失活将导致不能形成蓝色菌落。IPTG：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷.是乳糖的类似物。能诱导lac操纵子的启动转录，X-gal：5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D－半乳糖苷FusionproteinLac融合蛋白：插入片段与lacZ’基因具相同的可读框，且是连续的。其产生的融合蛋白是由来自lacZ’的N端的几个氨基酸及其紧连着的由插入片段所编码的蛋白序列组成。组氨酸标签融合蛋白：在表达蛋白ORF的N端加上一段组氨酸编码序列，以使重组蛋白可通过与Ni色谱柱的特异结合被纯化出来。

三、EnzymeforDNAcloning1、Alkalinephophatse碱性磷酸酶removesthephosphategroupsfromthe5’-endsofthevectorDNAlinearizedbyasinglerestrictionenzymetopreventtheself-ligationofthevectorDNAuponthefollowedligationSinglerestrictionenzymedirectedcloning去除线性载体分子5‘末端的磷酸基团，使载体在没有目的片段插入的情况下不能自连成环状，从而降低反应物中载体自身环化的比例。单一酶切指导的DNA克隆Theuseofalkalinephosphatetopreventreligationofvectormolecules使用碱性磷酸酶防止载体分子自身环化该切口将在转化后由细胞修复机制修补2限制性内切核酸酶：3DNA连接酶4TaqDNA聚合酶：5多核苷酸激酶：一个依赖ATP的反应，向双链或单链DNA或RNA的5’-OH添加磷酸。6末端转移酶：向线性单链或双链DNA或RNA的3’-OH添加核苷酸。7外切核酸酶III：从线性dsDNA的3’端依次切除核苷酸。8绿豆核酸酶：降解单链核酸，留下完整的双螺旋区段。9核酸酶S1：降解对应于互补链缺口对面的单链。10RNaseA：只降解RNA，而不降解DNA的核酸酶。11RNaseH：降解RNA-DNA异源双链中的RNA链的核酸酶。四、Screeninglibrary－SearchingthegenesofinterestinaDNAlibrary

通过杂交筛选目标基因放射性或荧光标记的DNA探针是与目的基因序列的某一区段互补或部分互补的一段DNA。从目标基因的蛋白产物序列推测出的一段寡核苷酸来自另一物种中的某一相关基因的一段DNA或寡核苷酸通过目标基因的蛋白质产物来筛选目标基因对其蛋白产物进行活性鉴定用特异抗体对其进行western杂交鉴定DNA-DNA或DNA-RNA链杂交。用放射性同位素（32P或125I）标记的DNA或RNA探针.hybridization用DNA（或RNA）探针检测DNA样品Southernblot

DNA的制备限制性酶切琼脂糖凝胶电泳Southernblot筛选结果用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。

Northernblot五、AnalysisandusesofclonedDNA克隆DNA的鉴定过程包括测定重组DNA分子的各种特性，如大小、限制图谱、核苷酸序列、基因的位置及方向。纯DNA样品的制备是克隆DNA鉴定的第一步。Characterization（鉴定）ofclonedDNAThesizeoftheclonedDNAcanbedeterminedbyrestrictiondigestion&agarosegelelectrophoresiswiththemolecularweightmarker1应用限制酶切、琼脂糖凝胶电泳及分子量标准可确定克隆DNA片段的大小。2、RestrictionMappingTherestrictionmapoftherecombinantDNAcanbebuilt①Bydigestionwithrestrictionenzymes,aloneandinconbinations,②Bypartialdigestionofend-labeledDNAusingpolynucleotidekinaseorterminaltransferase，andsizingoffragmentsproducedtherestrictionmapcanindicatingtheclevagepositionandfragmentsize.限制图谱的构建：①用一种或两种以上的限制酶对重组DNA分子进行酶解；②用限制酶对末端标记的DNA片段进行部分酶解,并测定所生成片段的大小；限制图谱可标明重组DNA分子的酶切位点和片段大小。CombinationalenzymedigestionPartialdigestionLabelingnucleicacid5’－endlabeling:requirepolynucleotidekinase

(多聚核苷酸激酶)toaddaphosphatetonucleicacidwithafree5’-OH,whichcanbecreatedbydephosphoprylationusingalkalinephosphatase(碱性磷酸酶).Theexternal–phosphateofATPisthesourceofthelabel.3’－endlabeling:requiretheterminaltransferase

(末端转移酶)toaddoneormorenucleotidestothe3’－endofnucleicacid.Uniformlabeling:requirepolymerases（聚合酶）tosynthesizeacompletelabeledstrand.

5’-末端标记:可用多核苷酸激酶将具放射活性的磷酸加到具有游离5’－OH的核酸上。游离的5’OH可由碱性磷酸酶去磷酸化产生。ATP的γ-磷酸是用来标记的标记源。3’-末端标记:可用末端转移酶向核酸的3’端加上一个或多个核苷酸进行。均匀标记：需用聚合酶完成一条完整的被标记链。3、NucleicacidsequencingDNAsequencingMaxamandGilbertchemicalmethodSanger’senzymicmethod

Sanger’senzymicmethod

Dideoxynucleotidesaschainterminatorsproducesaladderofmoleculesgeneratedbypolymeraseextensionofprimer；thenPAGEseparatesthemolecular。①ThesequencingprimerisannealedtoassDNAtemplatemolecule；②aDNApolymeraseextendstheprimerusingdNTP.TheextensionreactionissplitintofourandeachquarteristerminatedseparatlywithoneofthefourspecificddNTP；③thefoursamplesareanalyzedbyPAGE.Sanger的酶法：原理：双脱氧核苷酸作为链终止试剂，通过聚合酶的引物延伸产生一系列大小不同的分子。①测序引物与单链DN