PDX-1基因转染人脂肪间充质干细胞向胰岛样细胞分化及移植治疗1型糖尿病

PAGE2064P.O.Box10002PAGE3P.O.Box1200,··研究原著·PAGE2062P.O.Box10002PDX-1基因转染人脂肪间充质干细胞向胰岛样细胞分化及移植治疗1型糖尿病史光军1，白国立2，谭雪莹1，朱继军2，许评1(1青岛市市立医院肝胆外科，山东省青岛市266000；2青岛大学医学院，山东省青岛市266000)引用本文：史光军，白国立，谭雪莹，朱继军，许评.PDX-1基因转染人脂肪间充质干细胞向胰岛样细胞分化及移植治疗1型糖尿病[J].中国组织工程研究，2017，21(13):2062-2067.DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.13.016ORCID:0000-0002-6926-2354(史光军)文章快速阅读：PDX-1基因转染脂肪间充质干细胞向胰岛样细胞的分化能力及移植后对糖尿病大鼠的治疗效果PDX-1基因转染脂肪间充质干细胞向胰岛样细胞的分化能力及移植后对糖尿病大鼠的治疗效果第3代人脂肪间充质干细胞第3代人脂肪间充质干细胞人脂肪间充质干细胞的培养及鉴定检测大鼠血糖及体质量变化经尾静脉注入糖尿病SD大鼠模型检测大鼠血糖及体质量变化经尾静脉注入糖尿病SD大鼠模型携带PDX-1基因的人脂肪间充质干细胞携带PDX-1基因腺病毒的制备文题释义：胰十二指肠同源盒基因1：为一种在胰腺发育中起重要作用的特异性转录因子，对于胰腺的早期发育及晚期的增生分化均发挥着重要作用，并且对维持胰腺β细胞的功能也有重要作用。腺病毒(Adenovirus，Ad)：是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。腺病毒拥有近50个血清型，大多数腺病毒载体都是基于血清型2和血清型5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。重组腺病毒是进行基因转移和表达的工具，功能强大并易于操作。摘要背景：近年研究发现脂肪间充质干细胞不仅具有多向分化潜能，在血糖平衡及激素产生方面也具有重要作用。目的：观察PDX-1基因转染脂肪间充质干细胞向胰岛样细胞的分化能力及移植后对糖尿病大鼠的治疗效果。方法：采用腺病毒转染方法将PDX-1基因转入人脂肪间充质干细胞，双硫腙染色鉴定细胞分化情况，ELISA法检测细胞胰岛素分泌水平。从20只雄性SD大鼠中随机取4只作为对照组，注射生理盐水，其余16只按65mg/kg的剂量注射链脲霉素建立糖尿病模型，再随机等分为移植组和糖尿病组，移植组大鼠尾静脉注射PDX-1基因转染脂肪间充质干细胞。结果与结论：①转染后15d，转染组胰岛素阳性细胞数量、胰岛素分泌量均高于未转染组(P<0.05)；②移植组大鼠空腹血糖水平显著下降(P<0.05)，体质量明显增加(P<0.05)，而糖尿病大鼠空腹血糖维持在较高水平，且体质量显著下降；③结果提示，导入PDX-1基因对人脂肪间充质干细胞分化为胰岛样细胞具有促进作用，PDX-1转染脂肪间充质干细胞移植能有效治疗大鼠糖尿病，但具体机制尚待进一步研究。关键词：干细胞；移植；脂肪间充质干细胞；胰十二指肠同源盒基因1；腺病毒；基因转染；胰岛样细胞；糖尿病；血糖；体质量主题词：脂肪组织；间质干细胞移植；基因,同源盒；糖尿病；组织工程基金资助：山东省医药卫生科技发展计划(2014WS0217)PDX-1transfectedhumanadipose-derivedmesenchymalstemcells:differentiationintoislet-likecellsandtreatmentoftype1diabetesviacelltransplantationShiGuang-jun1,BaiGuo-li2,TanXue-ying1,ZhuJi-jun2,XuPing1(1DepartmentofHepatobiliarySurgery,QingdaoMunicipalHospital,Qingdao266000,ShandongProvince,China;2QingdaoUniversityMedicalCollege,Qingdao266000,ShandongProvince,China)史光军，男，1966年生，山东省潍坊市人，汉族，2005年华中科技大学同济医学院毕业，博士，主任史光军，男，1966年生，山东省潍坊市人，汉族，2005年华中科技大学同济医学院毕业，博士，主任医师，硕士生导师，主要从事肝胆胰脾疾病与干细胞的研究。通讯作者：许评，主任医师，教授，博士后导师，青岛市市立医院肝胆外科，山东省青岛市266000中图分类号:R394.2文献标识码:B文章编号:2095-4344(2017)13-02062-06稿件接受：2016-12-11ShiGuang-jun,M.D.,Chiefphysician,Master’ssupervisor,DepartmentofHepatobiliarySurgery,QingdaoMunicipalHospital,Qingdao266000,ShandongProvince,ChinaCorrespondingauthor:XuPing,Chiefphysician,Professor,DepartmentofHepatobiliarySurgery,QingdaoMunicipalHospital,Qingdao266000,ShandongProvince,ChinaBACKGROUND:Recentstudieshaveshownthatadipose-derivedmesenchymalstemcells(ADMSCs)notPAGE2065ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH4P.O.Box1200,Shenyang110004kf23385083@onlyhavemultilineagedifferentiationpotential,butalsoexertanimportantroleinbloodsugarbalanceandhormoneproduction.OBJECTIVE:ToobservethedifferentiationpotentialofhumanADMSCs(hADMSCs)intofunctionalislet-likecellsandthetherapeuticeffectofhADMSCstransplantationindiabeticrats.METHODS:PDX-1genewastransfectedintohADMSCsbyadenovirus.CelldifferentiationandinsulinsecretionwereidentifiedanddetectedbydithizonestainingandELISA,respectively.TwentymaleSprague-Dawleyratswererandomlydividedintocontrolgroup(n=4),diabetesgroup(n=8)andtransplantationgroup(n=8).Ratsinthelattertwogroupsweresubjectedtomakingdiabeticmodelsby65mg/kgstreptozotocininjection.Afterwards,ratsinthetransplantationgroupweregivenPDX-1transfectedADMSCsviathetailvein.RESULTSANDCONCLUSION:At15daysaftertransfection,thenumberofinsulinpositivecellsandinsulinsecretionwerebothincreasedsignificantly(P<0.05).Fastingglucoselevelsinthetransplantationgroupdecreasedsignificantly(P<0.05),whilethebodyweightincreasedsignificantly(P<0.05).Inthediabeticgroup,thefastingglucoselevelstillmaintainedatahighlevel,andthebodyweightofratswassignificantlydecreased.TheseresultsimplicatedthatPDX-1genecouldinducehADMSCsdifferentiatingintofunctionalislet-likecells.PDX-1transfectedADMSCstransplantationiseffectiveintreatingdiabeticrats,butthemechanismneedsfurtherstudy.Subjectheadings:AdiposeTissue;MesenchymalStemCellTransplantation;Genes,Homeobox;DiabetesMellitus;TissueEngineeringFunding:theMedicine&HealthDevelopmentPlanofShandongCitethisarticle:ShiGJ,BaiGL,TanXY,ZhuJJ,XuP.PDX-1transfectedhumanadipose-derivedmesenchymalstemcells:differentiationintoislet-likecellsandtreatmentoftype1diabetesviacelltransplantation.ZhongguoZuzhiGongchengYanjiu.2017;21(13):2062-2067.0引言Introduction对1型糖尿病患者来说，胰岛移植是目前很好的替代治疗方法之一，胰岛移植具有相对安全、不良反应少等优势[1]。虽然最近几年，临床胰岛移植研究取得了突破性的进展，但人们在移植部位、能否脱离外源性胰岛素控制和提高移植胰岛细胞的存活率等方面仍然面临着种种问题。近几年来，利用干细胞移植技术来克服胰岛短缺的问题成为人们研究的焦点，将具有某种特定功能的细胞移植到体内相应的受损部位，不仅避免了传统药物治疗引起的毒副作用，而且可以恢复受损器官部分功能[2]。脂肪间充质干细胞与骨髓间充质干细胞拥有相类似的细胞表型，均为CD73+、CD90+、CD105+、CD45-、CD34-[3]。脂肪间充质干细胞具有多向分化潜能，在特定的诱导培养条件下可向脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞及神经细胞等组织细胞定向分化，甚至可将其定向诱导为心肌细胞、角膜细胞等[4-5]，而且脂肪组织来源丰富，可反复取材，较少涉及医学伦理学问题[6]。PDX-1即胰十二指肠同源盒基因1(pancreaticandduodenalhomeoboxfactor-1,PDX-1)，作为一种在胰腺发育中起重要作用的特异性转录因子，对于胰腺的早期发育及晚期的增生分化均发挥着重要作用，并且对维持胰腺β细胞的功能也有着重要作用。PDX-1能调节与胰岛β细胞功能相关的基因表达，将PDX-1基因转染某些非胰岛β细胞(如骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、肝细胞)后，这些细胞均可以产生胰岛素[7-8]。通过转染PDX-1基因促进人脂肪间充质干细胞转化的研究尚未有报道。干细胞对降低血糖、改善临床症状及并发症已取得较好的疗效。目前，医学界对脂肪间充质干细胞应用于糖尿病治疗工作尚处于探索阶段，有不少问题尚需进一步解决。实验观察PDX-1基因转染人脂肪间充质干细胞向胰岛样细胞的分化能力及移植治疗糖尿病的效果。1材料和方法Materialsandmethods1.1设计细胞-基因学体外实验及随机对照动物实验。1.2时间及地点于2015年1至12月在青岛市市立医院卫生部细胞移植实验室完成。1.3材料1.3.1动物清洁级雄性SD大鼠20只，4周龄，体质量为160-180g，购自青岛市即墨动物中心。将动物置于18-25℃、12-121.3.2脂肪组织脂肪来源于青岛市市立医院肝胆外科35-50岁胆石症(无其他合并疾病)肥胖女性择期开腹手术患者，患者及家属均知情同意，研究通过院内伦理委员会批准。1.3.3主要试剂和仪器Ⅰ型胶原酶、双硫腙、链脲佐菌素(美国Sigma公司)；DMEM/F12、DMEM-低糖和DMEM-高糖培养液(美国HyClone公司)；胎牛血清(美国Gibco公司)；40g/L多聚甲醛、TritonX-100、胰蛋白酶抑制剂(北京Solarbio公司)；胰蛋白酶、4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(江苏碧云天生物科技研究所)；人胰岛素ELISA检测试剂盒(武汉博士德生物公司)；兔抗人CD29，CD73，CD49d，CD90，CD14，CD45，1.4实验方法1.4.1脂肪间充质干细胞的培养实验用脂肪取自肝胆外科手术患者，无菌条件获得腹部脂肪组织，在含双抗的1×PBS中浸泡5min并清洗5次，然后用无菌眼科剪剔除筋膜及小血管，剪碎至糊状，移入50mL离心管内，加入2倍于脂肪组织体积的0.15%Ⅰ型胶原酶，37℃水浴振荡消化45min，待管内液体消化至均匀乳白色液体时，1500r/min离心10min，去除上层未消化的脂肪组织，加入等体积DMEM/F12培养液(含体积分数为10%胎牛血清)终止消化并混匀，无菌200目细胞筛网过滤，滤液在室温条体积分数为15%CO2)中培养。待241.4.2脂肪间充质干细胞的鉴定使用CD29CD73CD49dCD90为脂肪干细胞的阳性指标，CD14CD45CD34HLA-DR为阴性指标单抗标记脂肪间充质干细胞，流式细胞仪检测其纯度。脂肪间充质干细胞成脂肪诱导2周后对其进行油红O染色，成骨诱导2周后对其进行碱性磷酸酶染色。1.4.3携带PDX-1基因的腺病毒制备携带PDX-1基因的腺病毒由山东维真生物科技有限公司暨美国ViGeneBiosciences公司中国办事处合成：pdx-1基因由NM00029基因序列克隆至pAD-Amp载体，腺病毒对其包装，载体C端带有His，Flag标签。研究选用的腺病毒载体为人类血清5型腺病毒。1.4.4重组腺病毒对脂肪间充质干细胞的转染将状态良好的第3代脂肪间充质干细胞接种到6孔板，保证第2天进行病毒感染的时候细胞汇合率介于50%-70%之间。感染养481.4.5Westernblot检测转染细胞PDX-1的表达留取转染组、未转染组贴壁生长的细胞应用PBS冲洗2次，将细胞移至EP管中，1500r/min离心5min，弃上清液，加入蛋白裂解液裂解细胞，取50μL蛋白液与10μL5×上样缓冲液混合，100℃变性10min(以上每步均在冰袋上操作)。提取蛋白样品，8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭，兔抗人单克隆抗体作为一抗(1︰800)孵育4℃过夜，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG作为二抗(1︰11.4.6免疫荧光染色方法检测转染细胞PDX-1的表达首先用40g/L多聚甲醛室温固定细胞20min，然后用1%TritonX-100穿透细胞45min，再用5%BSA封闭40min；滴加兔抗人的PDX-1单克隆抗体(1︰400)，4℃过夜；滴加FITC标记荧光抗体(山羊抗兔，1︰200)，避光室温孵育1.5h；每1.4.7双硫腙(DTZ)染色将转染诱导后15d的细胞用D-Hank’s缓冲液冲洗2遍，加入1mLD-Hank’s缓冲液及10μL双硫腙贮存液，37℃孵育301.4.8ELISA法检测细胞胰岛素分泌水平细胞转染诱导结束后15d，用1×PBS缓慢冲洗2遍，先用浓度5.5mmol/L低糖DMEM培养基，37℃温箱孵育1h，吸出培养液备用；1×PBS缓慢冲洗2次，再加入浓度25.0mmol/L高糖DMEM培养基，371.4.9实验动物分组20只SD大鼠中取4只作为对照组，其余16只建立糖尿病模型。造模成功后，大鼠随机等分为移植组和糖尿病组，移植组大鼠移植脂肪间充质干细胞。1.4.10糖尿病大鼠模型的建立大鼠禁食24h48h后测量随机血糖，血糖浓度超过16.8mmol/L时为糖尿病模型制备成功。1.4.11脂肪间充质干细胞移植移植组大鼠造模成功后立即通过尾静脉注入1mL转染诱导后脂肪间充质干细胞(细胞浓度为1.5×109L-1.5主要观察指标①脂肪间充质干细胞的培养与鉴定结果；②Westernblot和荧光显微镜观察转染后细胞PDX-1基因表达；③双硫腙染色结果；④ELISA法检测细胞胰岛素分泌水平；⑤移植后大鼠血糖及体质量的变化。1.6统计学分析实验数据使用SPSS19.0统计软件进行统计学分析，数据以±s表示，两组间比较采用t检验，P<0.05为差异有显著性意义。2结果Results2.1脂肪间充质干细胞的培养与鉴定结果接种24h之后换液去除非贴壁细胞；两三天可见细胞形态改变，较均一，成纤维细胞样生长，细胞生长有极性，融合后呈螺旋状(图1)。流式细胞术检测脂肪间充质干细胞高表达分子表型CD29，CD73，CD49d，CD90，低表达分子表型CD14，CD45，CD34，HLA-DR(图2)。脂肪间充质干细胞成脂肪诱导2周后油红O染色阳性，证明其成脂分化能力(图3A)；脂肪间充质干细胞成骨诱导2周后碱性磷酸酶染色呈强阳性反应，证明其成骨分化能力(图3B)。BABA图1图1第3代人脂肪间充质干细胞(×200)Figure1Passage3humanadipose-derivedmesenchymalstemcells(×200)图3图3脂肪间充质干细胞成脂成骨诱导分化能力Figure3Adipogenicandosteogenicdifferentiationpotentialsofhumanadipose-derivedmesenchymalstemcells图注：图中A为脂肪间充质干细胞成脂肪诱导2周后油红O染色阳性，证明其成脂分化能力；B为脂肪间充质干细胞成骨诱导2周后碱性磷酸酶染色呈强阳性反应，证明其成骨分化能力。图4图4转染后2d脂肪间充质干细胞PDX-1免疫荧光染色(×200)Figure4PDX-1immunofluorescencestainingofadipose-derivedmesenchymalstemcells2daysaftertransfection(×200)图2图2脂肪间充质干细胞流式细胞仪鉴定结果Figure2Flowcytometrydetectionofhumanadipose-derivedmesenchymalstemcells图注：流式细胞术检测脂肪间充质干细胞高表达分子表型CD29，CD73，CD49d，CD90，低表达分子表型CD14，CD45，CD34，HLA-DR。图6转染后15d漂浮的胰岛样细胞双硫腙染色呈阳性(×400)Figure图6转染后15d漂浮的胰岛样细胞双硫腙染色呈阳性(×400)Figure6Floatingislet-likecellspositivefordithizonestainingat15daysaftertransfection(×400)β-actin图5Westernblot法检测转染后脂肪间充质干细胞中PDX-1的表达Figure5WesternblotdetectionofPDX-1expressionintransfectedadipose-derivedmesenchymalstemcells图注：1：PDX-1转染后2d；2：PDX-1转染后15d；3：对照组。PDX-11232.2转染后细胞PDX-1的表达脂肪间充质干细胞在感染PDX-148h后Westernblot法和免疫荧光法均可检测到PDX-1的表达，对照组无PDX-1的表达，且病毒感染后15d，仍能检测到PDX-1的表达(图4，5)。2.3双硫腙染色结果对转染后细胞进行双硫腙染色，对照组未出现胰岛素阳性细胞，实验组出现双硫腙阳性细胞且被染成棕红色(图6)。2.4细胞胰岛素分泌水平转染组和对照组细胞在低糖环境下分泌的胰岛素量差异无显著性意义(P>0.05)，而在高糖环境下分泌的胰岛素量两组之间差异有显著性意义(P<0.05)，对照组细胞在刺激前后分泌的胰岛素量差异无显著性意义(表1)。2.5PDX-1转染脂肪间充质干细胞移植对糖尿病大鼠空腹血糖的影响大鼠注射链脲佐菌素48h后，与对照组相比，模型组大鼠空腹血糖明显增加(P<0.05)，且明显高于正常值；给药后2周，大鼠空腹血糖仍维持在较高水平，且高于对照组(P<0.05)，见表2。糖尿病大鼠细胞移植后空腹血糖逐渐下降，14d时空腹血糖水平明显低于糖尿病组(P<0.05)。糖尿病组大鼠空腹血糖维持较高水平，未见明显变化，见表3。2.6PDX-1转染脂肪间充质干细胞移植对糖尿病大鼠体质量的影响细胞移植后，移植组大鼠体质量逐渐增加，14d时大鼠体质量明显高于糖尿病组(P<0.05)，而糖尿病组大鼠体质量持续下降，见表4。PAGE2067ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH4P.O.Box1200,Shenyang110004kf23385083@表表1葡萄糖刺激诱导后各组细胞胰岛素分泌量(±s，n=12，μg/L)Table1Insulinsecretionineachgroupafterglucosestimulation表注：在高糖环境下，与对照组相比，aP<0.05。组别高糖刺激低糖刺激对照组转染组6.90±0.6414.38±0.66a6.69±0.547.78±0.72表表2大鼠注射链脲佐菌素后不同时间段血糖变化(±s，mmol/L)Table2Bloodglucosechangesinratsatdifferenttimeafterstreptozotocininjection表注：与对照组相比，aP<0.05。造模后时间对照组(n=4)造模组(n=16)24h48h7d14d5.43±0.545.44±0.545.51±0.465.46±0.5212.69±1.26a21.00±3.2221.43±3.4420.78±3.72表表3PDX-1转染脂肪间充质干细胞移植对糖尿病大鼠血糖的影响(±s，mmol/L)Table3EffectofPDX-1transfectedadipose-derivedmesenchymalstemcellsonbloodglucoselevelindiabeticrats时间时间移植组(n=8)糖尿病组(n=8)对照组(n=4)移植前移植3d移植7d移植14d21.48±3.13a14.01±2.08a9.42±1.51ab7.90±1.28b21.00±3.17a19.75±1.89a18.89±2.33a18.26±2.325.42±0.585.45±0.465.44±0.585.47±0.48表注：表注：与对照组相比，aP<0.05；与糖尿病组相比，bP<0.05。表表4PDX-1转染脂肪间充质干细胞移植对糖尿病大鼠体质量的影响(±s，g)Table4EffectofPDX-1transfectedadipose-derivedmesenchymalstemcellsonbodymassindiabeticrats表注：与对照组相比，aP<0.05；与糖尿病组相比，bP<0.05。时间移植组(n=8)糖尿病组(n=8)对照组(n=4)移植前移植3d移植7d移植14d157.3±3.1a159.4±2.8a164.6±1.5ab158.3±2.4a156.7±1.8a152.2±3.3170.4±4.8169.5±4.6170.5±5.0170.2±4.83讨论Discussion1型糖尿病主要是由于胰岛β细胞被破坏导致胰岛素绝对缺乏引起[9-10]。研究表明，1型糖尿病发病机制为自身体内的CD4+和CD8+T淋巴细胞共同参与自身抗原耐受破坏，引起选择性胰岛细胞破坏和功能衰竭，最终导致胰岛素分泌不足，引起糖尿病症状。胰岛素治疗已成为治疗当前1型糖尿病的主要方式，虽然它能稳定患者的血糖状态改善生活质量，但并不能延缓糖尿病并发症的发生。所以，1型糖尿病的细胞替代治疗方法越来越受到重视。脂肪间充质干细胞因含量丰富，易于分离，而受到广泛关注[11]。近年研究发现脂肪间充质干细胞不仅具有多向分化潜能，在血糖平衡及激素产生方面也具有重要作用[12]，在治疗糖尿病方面的研究也越来越多。有报道显示脂肪间充质干细胞与骨髓间充质干细胞相比能更好的被诱导为胰岛样细胞[13]，是胰岛素分泌细胞来源的理想选择。实验选择Ⅰ型胶原酶消化法，成功从脂肪中获取高纯度的脂肪间充质干细胞。PDX-1基因是胰腺发育和胰腺前体细胞分化为β细胞的主要调控因子，胚胎发育早期，PDX-1在内分泌细胞和外分泌细胞中均有表达，其能诱导内胚层向胰腺定向发育和成熟，活化后可促进β细胞中重要基因的表达以及维持β细胞的正常功能，随着胰腺的发育，PDX-1最终仅限于在β细胞内表达[14-16]。干细胞分化为胰岛素细胞的原理是启动干细胞PDX-1基因的表达[17]，从而表达更多胰岛细胞特异性基因，使干细胞功能和形态发生改变[18]。已有研究显示，小鼠脂肪干细胞过表达PDX-1，能够诱导其表达出胰腺特定转录因子Ngn3、Nkx2-2、insulin1[19-21]。重组腺病毒是进行基因转移和表达的工具，首先，它能够感染包括分裂、非分裂细胞和干细胞在内的多种细胞；第二，病毒滴度高；第三，高滴度的病毒可获得高感染率和高表达量；第四，病毒进入细胞后，病毒基因组不整合到细胞染色体上。由于腺病毒的独特特征而倍受研究者喜爱有研究显示，给予糖尿病患者移植干细胞可有效改善糖尿病末期患者肾脏功能，提高患者存活率[26-27]。大鼠注射链脲霉素48h后与对照组相比，模型组大鼠空腹血糖明显增加，故大鼠造模成功，移植组大鼠给予PDX-1转染脂肪间充质干细胞，大鼠空腹血糖逐渐下降，2周时空腹血糖水平仍明显低于糖尿病组。而糖尿病组大鼠空腹血糖维持较高水平，无明显变化。移植PDX-1转染脂肪间充质干细胞的大鼠体质量逐渐增加，2周时大鼠体质量明显高于糖尿病组，而糖尿病组大鼠体质量持续下降。实验结果提示PDX-1转染脂肪间充质干细胞移植可以有效降低糖尿病大鼠血糖，这对人类应用脂肪间充质干细胞治疗糖尿病而言具有重要借鉴意义。但是腺病毒携带PDX-1转染脂肪间充质干细胞在大鼠体内定位情况、对大鼠的毒副作用以及治疗糖尿病的分子机制尚需进一步实验证实。综上所述，人类脂肪组织来源的间充质干细胞容易获得，通过腺病毒携带PDX-1基因转染人脂肪间充质干细胞的方式，能够诱导其向胰岛样细胞方向分化，用脂肪干细胞衍生来源的胰岛素细胞进行细胞替代疗法，在未来1型糖尿病治疗方面具有广阔的研究前景和应用价值。作者贡献：实验设计为史光军，实验实施为白国立、谭雪莹、朱继军，资料搜集为史光军、白国立。利益冲突：所有作者共同认可文章无相关利益冲突。伦理问题：实验方案经青岛市市立医院伦理委员会批准，脂肪组织取材已经取得患者/家属知情同意，实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethicalissuesinanimalexperimentation》相关动物伦理学标准的条例。文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。作者声明：第一作者及通讯作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。开放获取声明：这是一篇开放获取文章，文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。根据《知识共享许可协议》“署名-非商业性使用-相同方式共享3.0”4参考文献ReferencesNoguchiH,IwanagaY,OkitsuT,etal.Evaluationofislettransplantationfromnon-heartbeatingdonors.AmJTransplant.2006;6(10):2476-2482.DraginN,DaltonTP,MillerML,etal.Fordioxin-inducedbirthdefects,mouseorhumanCYP1A2inmaternalliverprotectswhereasmouseCYP1AGirP,OniG,BrownSA,etal.Humanadiposestemcells:currentclinicalapplications.PlastReconstrSurg.2012;129(6):1277-1290.LiQ,QiLJ,GuoZK,etal.CD73+adipose-derivedmesenchymalstemcellspossesshigherpotentialtodifferentiateintocardiomyocytesinvitro.JMolHistol.2013;44(4):411-422.ParkA,HoganMV,KesturuGS,etal.Adipose-derivedmesenchymalstemcellstreatedwithgrowthdifferentiationfactor-5expresstendon-specificmarkers.TissueEngPartA.2010;16(9):2941-2951.HeQ,WanC,LiG.Concisereview:multipotentmesenchymalstromalcellsinblood.StemCells.2007;25(1):69-77.YoshidaS,KajimotoY,YasudaT,etal.PDX-1inducesdifferentiationofintestinalepithelioidIEC-6intoinsulin-producingcells.Diabetes.2002;51(8):2505-2513.王博,吴汉青,吴河水,等.胰十二指肠同源框基因-1联合细胞因子诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛β样细胞的研究[J].中华胰腺病杂志,2011,11(1):43-47.SilveiraPA,JohnsonE,ChapmanHD,etal.ThepreferentialabilityofBlymphocytestoactasdiabetogenicAPCinNODmicedependsonexpressionofself-antigen-specificimmunoglobulinreceptors.EurJImmunol.2002;32(12):3657-3666.HulbertC,RiseiliB,RojasM,etal.Bcellspecificitycontributestotheoutcomeofdiabetesinnonobesediabeticmice.JImmunol.2001;167(10):5535-5538.NajarM,RaicevicG,BoufkerHI,etal.Adipose-tissue-derivedandWharton'sjelly-derivedmesenchymalstromalcellssuppresslymphocyteresponsesbysecretingleukemiainhibitoryfactor.TissueEngPartA.2010;16(11):3537-3546.YanaiG,HayashiT,ZhiQ,etal.Electrofusionofmesenchymalstemcellsandisletcellsfordiabetestherapy:aratmodel.PLoSOne.2013;8(5):e64499.KaraozE,OkcuA,ÜnalZS,etal.Adiposetissue-derivedmesenchymalstromalcellsefficientlydifferentiateintoinsulin-producingcellsinpancreaticisletmicroenvironmentbothinvitroandinvivo.Cytotherapy.2013;15(5):557-570.BramswigNC,KaestnerKH.Organogenesisandfunctionalgenomicsoftheendocrinepancreas.CellMolLifeSci.2012;KhooC,YangJ,WeinrottSA,etal.Researchresource:thepdx1cistromeofpancreaticislets.MolEndocrinol.2012;26(3):521-533.CerfM