玉米穗轴对穗腐病抗性鉴定体系及优异抗源研究

玉米穗轴对穗腐病抗性鉴定体系与优异抗源的研究1王昭1，穆聪1，李云梦1，高景阳1，宋云霞1，董朝沛1，马培培1，赫可伟1，许静1，董华芳1，孙小东

1，韩亚楠1，周子健1，陈甲法2，吴建宇1（1.河南农业大学农学院，郑州450002；2.河南农业大学生命科学学院，郑州450002）摘要:穗轴作为拟轮枝镰孢菌侵染果穗引发玉米穗腐病的重要途径之一，能够影响病原菌的侵染和扩散。为了深入开展玉米穗轴对拟轮枝镰孢菌抗性的研究以及了解玉米穗腐病籽粒与穗轴抗性的差异，本研究进行了抗性鉴定体系的优化，并进一步利用164份国内外玉米骨干自交系进行了两年两点的接种鉴定筛选优异抗源。通过对发病边长、发病芯长、发病面积、发病相对面积等4个抗性指标进行研究，发现其中发病边长能较大程度地区分不同自交系间的抗感差异且又在材料内具有较好的重演性，因此把发病边长确定为玉米穗腐病穗轴抗性鉴定指标，进而对参试自交系进行了抗性评价，鉴定出CML27、BT-1、CML274等58份穗轴高抗自交系，同时筛选出BT-1、CML173、CML193等8份籽粒与穗轴均抗穗腐病的优异抗源，为玉米穗腐病抗性遗传研究以及抗病育种工作奠定了基础。关键词：玉米穗腐病；穗轴抗性；鉴定指标；优异抗源StudyonCobInoculationSystemandEliteResistantInbredLinesScreenedtoMaizeEarRotWANGZhao1，MUCong1，LIYun-meng1，GAOJing-yang1，SONGYun-xia1，DONGChao-pei1，MAPei-pei1，HEKe-wei1，XUJing1，DONGHua-fang1，SUNXiao-dong1，HANYa-nan1，ZHOUZi-jian1，CHENJia-fa2，WUJian-yu1（1.CollegeofAgronomy,HenanAgricultureUniversity,Zhengzhou450002;2.CollegeofLifeScience,HenanAgricultureUniversity,Zhengzhou450002,China）Abstract:Asanimportantpathway,cobcanaffecttheinfectionandspreadofFusariumverticillioideinmaizeear.InordertostudythecobresistancetoFusariumverticillioideandtounderstandthedifferencebetweenkernelresistanceandcobresistanceinmaize,theidentificationsystemofcobresistancewasoptimized.Inaddition,164inbredlinesweresurveyedtoestablishthecobresistanceidentificationsystemandtoselectexcellentresistanceinbredlinesintwoyearsandtwolocations.By基金项目：国家自然科学基金项目（31671281）、国家自然科学基金项目（31761143009）作者简介：王昭（1994-）,河南邓州人，硕士，研究方向为作物遗传育种。E-mail：475356602@吴建宇为本文通讯作者。E-mail：wujianyu40@126.comanalyzedofthefourindexes(surroundinginfectedlength,internalinfectedlength,infectedareaandrelativeinfectedarea),thesurroundinginfectedlengthwasidentifiedasoptimal,whichhasbetterrepeatabilityinsameinbredlineandcaneasierdistinguishtheresistancebetweendifferentinbredlines.Fifty-eightinbredlineswithhighresistanceofcobwereidentified,suchasCML27,BT-1,CML274,etc.Atthesametime,eliteinbredlinesBT-1,CML173,CML193andothereightinbredlineswithhighresistancetoearrotinbothkernelandcobwerescreenedout.Theseresultslaidafoundationfordiseaseresistancebreedingandresistanceinheritanceresearch.Keywords:MaizeEarRot;ResistanceofCob;Identificationindex;EliteInbredLines玉米穗腐病是世界上普遍发生、危害严重、防治困难的一种真菌性病害，其中拟轮枝镰孢菌是优势病原菌之一［1,2,3］。病原菌从玉米苗期到成熟期以及收获后籽粒脱粒期均可侵染，主要通过花丝和籽粒的伤口进行侵染，还可以通过输导组织从根或茎传至穗轴，进而侵染籽粒［4-6］。随着我国黄淮海地区小麦-玉米轮作以及秸秆还田技术的普及与推广，致病镰孢菌循环侵染并在土壤中大量积累，导致穗腐病的发生逐年加重［4］。穗轴既是病原菌从植株内部自根向上侵染玉米籽粒的通道，也是病原菌从外部经花丝侵染果穗后加快扩散的重要途径。此外，玉米害虫蛀蚀并在穗轴内寄生，也会加速病原菌的侵染和扩散［7］。Oldenburg等网通过对毒素分布的研究，发现毒素含量自穗轴顶端到基部呈现由高到低的趋势，并且穗轴内毒素的积累相对于籽粒更高，表明镰孢菌主要由穗轴顶端向基部传播，籽粒随后被侵染。Morales等［9］认为穗轴的形态特征与拟轮枝镰孢菌危害程度和伏马毒素的污染水平相关。同时，玉米穗腐病的发生存在组织特异性，表现出籽粒与穗轴发病不同步的现象［10］。穗轴感病的果穗在拟轮枝镰孢菌侵染后期会形成爆发趋势，加重了穗腐病的发生，造成了穗轴松软腐烂，严重影响玉米机械化收获。在注重玉米籽粒抗性的同时，加强穗轴抗性的选择，能够有效抑制病原菌的侵染和扩散。本研究参考前期使用的针刺果穗法并完善穗轴抗性鉴定体系，利用多个指标、多个环境对供试自交系接种并进行抗性鉴定，筛选优异抗源，进而进行抗性评价。从穗轴抗性的角度加深对玉米穗腐病的认识，为深入开展玉米抗穗腐病遗传机制的研究以及抗病育种工作奠定基础。1材料与方法供试材料供试材料为164份优良玉米自交系，包括Reid、Lancaster、塘四平头、旅大红骨、P群和CIMMYT的热带、亚热带自交系。试验采用病原菌为拟轮枝镰孢菌（Fusariumverticillioide）。试验设计2014年6月与2015年6月，分别在郑州河南农业大学科教园区（北纬N34°51‘56.34〃东经EU3°35′5.70〃）、温县平安种业基地（北纬N34°56‘59.26〃东经E112°59‘26.35〃）进行田间试验，采用随机区组试验设计，每个地点两次重复，每个重复种植一行，每行种植20穴，每穴2粒。行长为4m，行距0.67m,株距0.21m，3~5叶期进行间苗、定苗。进行常规的田间管理，并在喇叭口期，采用呋喃丹颗粒灌芯的方法进行玉米螟防治；在生育后期，喷施2.5%的高效氯氟氰菊酯2000-2500倍液，对玉米螟、黏虫、棉铃虫等玉米地上害虫进行防治。接种体系接种时期根据供试材料的吐丝期，集中分3~4批进行人工辅助授粉，授粉15天后接种。此时雌穗的形态特征为花丝呈暗棕色或褐色，而籽粒内部充满浆汁。接种方法参考针刺果穗法［11-13］，孢子悬浮液浓度为5x106个/mL，接种量为1mL。接种时菌液加入吐温-80，浓度约为2］iL/mL。用自制连续注射器进行接种，接种点选在果穗中部向下1~2厘米处，接种至穗轴上，用纸胶带封住接种口，防止菌液外流以及玉米螟危害。表型调查与抗性鉴定接种30天后收获果穗并晒干，将玉米穗轴纵向锯开后观察。病原菌侵染的穗轴髓部呈棕褐色，用标尺进行测量，病原真菌侵染穗轴的横向长度等于轴粗。将病原菌沿籽粒基部侵染的纵向长度定义为发病边长，将病原菌在穗轴髓部侵染的纵向长度定义为发病芯长，将发病边长和轴粗的乘积定义为发病面积，将发病面积和穗轴横切面面积的比值定义为相对发病面积。玉米穗腐病穗轴的抗性评价利用参考品种法［14］，将参试自交系分为高抗（HR）、抗（R）、中抗（MR）、感（S）、高感（HS）等5个等级（表1）。a为20个极抗材料的平均值，b为20个极感材料的平均值，d=（b-a）/8，PV为表型值。表1玉米穗轴抗性评价标准Table1Evaluationofcobresistanceinmaize

抗性评价Evaluationofcobresistance表型值phenotypicvalue高抗(HR)PV<a+d抗(R)a+d<PV<a+3d中抗(MR)a+3d<PV<a+5d感(S)a+5d<PV<a+7d高感(HS)PV>a+7d1.6数据分析使用MicrosoftOfficeExcel2016进行数据统计与方差分析和变异系数的计算及图表的绘制。使用IBMSPSSStatistics21软件进行相关性分析。2.结果与分析玉米穗腐病穗轴的抗性指标研究从164个供试材料中随机选择30份自交系，进行4个抗性指标(发病边长、发病芯长、发病面积、相对发病面积)的平均数与变异系数比较分析，发现发病边长平均数的范围为0.38~10.90；发病芯长平均数的范围为0.03~9.55；发病面积平均数的范围为0.48~32.62；相对发病面积平均数的范围为0.03~0.88。材料内发病边长的变异系数普遍较小，其次是相对发病面积、发病面积与发病芯长(表2)。分析表明，发病边长在4个抗性指标中重复性最好，实验误差较小。表24个抗性指标的平均数及变异系数Table2Meanandcoefficientofvariationoffourresistanceindexes材料Material发病边长Surroundinginfectedlength发病芯长Internalinfectedlength发病面积Infectedarea相对发病面积Relativeareainfected平均数Mean变异系数CV平均数Mean变异系数CV平均数Mean变异系数CV平均数Mean变异系数CVCML1890.390.360.071.730.480.40.030.4CML2740.411.060.112.451.241.360.031.05CML1530.450.750.181.451.370.840.040.75CML4950.490.230.270.871.650.240.040.23(BT-N6)RIL2250.541.28CML2230.531.220.281.480.681.410.031.22CML850.530.771.080.040.78CML4920.540.730.141.781.40.940.040.7CML4730.570.440.660.060.45CML1810.570.770.032.831.490.810.040.83CML1730.60.730.191.581.690.940.040.73

CML4210.60.910.271.671.841.010.040.92CML3040.620.720.172.080.880.870.040.76CML1930.620.510.251.852.040.690.040.49BT-10.381.450.081.860.781.30.021.44CML1392.150.731.710.953.80.980.140.7512H563-1-TSPT212.191.530.492.514.861.580.21.46CML1452.290.582.290.582.940.640.230.62CML2582.30.381.850.635.820.830.170.3912H563-1-TSPT132.320.641.191.366.260.730.240.64CML2822.70.570.871.154.510.620.320.67CML1542.720.581.480.834.590.890.160.87（BT-N6）RIL1072.811.461.711.723.781.540.181.46（BT-N6）RIL1622.870.782.010.817.7812H577-1-Reid63.470.62.860.8913.740.790.30.6112H664-1-Reid103.530.972.311.4614.211.480.240.8912H690-1-PB16.720.816.50.8926.971.040.450.76N66.930.695.850.8718.841.390.680.65（BT-N6）RIL647.480.647.220.7219.420.680.650.62西5050.4532.620.410.880.1对164个供试材料的4个指标的均值进行分析（表3），发现发病芯长和发病边长的变异系数较大，分别为1.93和1.59，而发病面积和发病相对面积的变异系数较小，分别为1.02和0.95。说明发病芯长与发病边长能够较大程度地区分开不同材料间的抗性差异。表3164个供试自交系4个抗性指标均值及变异系数Table3Meanandcoefficientofvariationoffourresistantindexesbetween164testmaterials指标平均值标准差变异系数（％）IndexMeanStandarddeviationCV发病边长1.492.371.59发病芯长1.342.581.93发病面积4.254.341.02发病相对面积5 进而对4个抗性指标进行相关性分析（表4），发现4个指标间均极显著相关。结合各指标变异系数分析结果，发病边长既能较大程度地区分不同自交系间的抗感差异，又能降低材料内的误差，重复性好，因此把发病边长确定为玉米穗腐病穗轴抗性指标，以此为指标开展后续的穗轴抗性鉴定以及抗性遗传研究。表44个抗性指标的相关性分析结果Table4Correlationanalysisoffourindicators指标Index发病边长Surroundinginfectedlength发病芯长Internalinfectedlength发病面积Infectedarea发病相对面积Relativeareainfected发病边长1发病芯长0.938**1发病面积0.902**0.844**1发病相对面积0.966**0.902**0.867**1注：**表示在0.01水平上差异显著。Note:**indicatedthesignificantlevelat0.01.参试自交系玉米穗腐病穗轴的抗性评价以发病边长为抗性指标，对164份参试材料进行了抗性评价(表5)，结合穗轴抗性评价标准，从中筛选出58份高抗自交系与75份抗病自交系，而18份自交系鉴定为中抗，另外13份自交系鉴定为感病或高感。其中，CML27、BT-1、CML274、CML153、(BT-N6)RIL225、CML85、CML492、CML473、CML333、CML181、CML173、CML288、CML421、CML304、CML193等自交系抗性突出，具有潜在的利用价值。表5供试材料的抗性评价Table5Resistantevaluationforthe164testmaterials抗性评价Evaluationofresistance材料(份)Material(number)发病边长Surroundinginfectedlength高抗(HR)58PV<1.01抗(R)751.01<PV<1,99中抗(MR)181.99<PV<2,96感⑸52.96<PV<3.94高感(HS)83.94<PV进一步对参试材料进行类群分析，结合抗性鉴定结果发现，164份玉米自交系中来自CIMMYT的热带、亚热带自交系占97份，其中高抗自交系45%，抗病及中抗自交系50%，而感与高感自交系仅有5%，这说明在取样上热带、亚热带自交系偏多，CIMMYT的热带、亚热带自交系拥有丰富的穗轴抗病资源。玉米籽粒与穗轴对拟轮枝镰孢菌抗性的比较结合玉米穗腐病籽粒抗性鉴定结果，将穗轴与籽粒对拟轮枝镰孢菌抗性结果进行比较(表8)，发现多数自交系抗性鉴定结果一致，如籽粒和穗轴均高抗自交系BT-1、CML173、CML193等；均高感自交系N6、XI502、12H577-1-Reid6等，但有些自交系鉴定结果不一致，如穗轴抗病籽粒感病的自交系CML244、5H10-1、772-2-1-1,穗轴感病籽粒抗病的自交系(BT-N6)RIL64、10H1-1、276。这说明玉米籽粒与穗轴对拟轮枝镰孢菌的抗性机制并

不一致，玉米果穗不同组织（籽粒与穗轴）对真菌抗性的差异反映出玉米穗腐病抗性机制的复杂性。选择穗轴与籽粒均抗的材料并挖掘利用双抗的基因资源，才能够有效防止穗腐病的发生。表8籽粒与穗轴对拟轮枝镰孢菌的抗性评价Table8EvaluationofkernelandcobresistancetoFusariumverticillioide自交系穗轴抗性籽粒抗性InbredlineCobresistanceKernelresistanceBT-1HRHRCML173HRHRCML193HRHRCML182HRHR12H378-1HRHRCML497HRHRCML169HRHRCML312HRHRN6HSHSXI502HSHS12H577-1-Reid6HSHS12H560-1-TSPT10HSHS12H666-1-Reid20HSHSCML244HRHS12H650-1-TSPT4HRHS12H569-1-TSPT26HRHS(BT-N6)RIL64HSHR12H690-1-PB1HSHR2397-276HSHR2.5玉米穗腐病穗轴接种与鉴定体系的优化随着对穗轴抗性研究的逐步深入，进一步对穗轴接种和鉴定体系进行了优化。用手持电钻进行钻孔，再将菌液注射到穗轴内，有效提高了穗轴接种效果。其次，通过鉴定指标的分析，发现病原菌侵染穗轴的发病芯长和发病边长重叠，将两个调查指标合二为一，将病原菌在穗轴侵染的纵向长度定义为发病长度。应用改良的接种方法以及优化的抗性指标进行研究，利用抗感存在显著差异的自交系BT-1（抗）和西502（感）构建分离群体，对发病长度和发病相对面积2个抗性指标的变异系数进行比较（表9），发现新的抗病指标发病长度可以更好地区分分离群体中不同材料间的抗感差异。表9分离群体中2个指标的均值和变异系数Table9Meanandcoefficientofvariationoftwoevaluationindexesinthesegregationpopulation指标 平均 标准差 变异系数—Index Mean Standarddeviation CV

发病长度

相对发病面积4.2787950.3624962.563555发病长度

相对发病面积4.2787950.3624962.5635550.2035690.599130.5615763.结论与讨论通过对164份材料人工接种拟轮枝镰孢菌，进行玉米穗腐病穗轴抗性研究，发现发病长度不仅能够较大程度地反映出不同材料间的抗性差异，而且能够降低试验误差提高重演性，可以作为穗轴抗性评价的指标。利用较为完善的抗性鉴定体系进行抗性评价，筛选出58份高抗自交系，血缘追踪发现这些自交系多属于热带、亚热带材料。结合前期进行的籽粒抗性评价结果，发现籽粒抗性与穗轴抗性不一致的现象，并筛选出8个籽粒与穗轴均抗的优异抗源，为抗穗腐病玉米新品种的选育以及遗传研究奠定了基础。通过对接种体系的完善和鉴定体系的建立，在接种30天后进行调查。但是材料间生育时期存在差异，为了减小试验误差，应按照材料生育期进行分批接种和抗性鉴定；同时，应在多个时期进行有效防虫，避免因虫害引发穗腐病和蛀蚀穗轴而影响试验。国内外对玉米穗腐病抗性研究多集中在籽粒抗性、种子抗性和花丝抗性上，对穗轴抗性研究较少。不同玉米自交系的花丝、籽粒和穗轴对拟轮枝镰孢菌的抗性不同［16］。本研究组以穗轴、籽粒高抗穗腐病的自交系BT-1,穗轴高感穗腐病的自交系西502及熊掌为材料，进行了穗轴抗性遗传研究，已鉴定出4个QTL,分别位于第2、3、4、6染色体［17］。在此基础上，利用NIL群体对主效QTLqRcfv2进行了精细定位，把定位区间缩小到标记mcfv8和M2-4之间，结合关联分析结果，初步确定了两个候选基因GRMZM2G153268和GRMZM2G027049［10］。通过转录组分析初步确定候选基因GRMZM2G010909，推测该基因在响应机械损伤或病原体侵染过程中，以修复受损组织和产生次生代谢物,并修饰细胞壁结构,形成真菌传播的屏障［18］。茉莉酸在禾本科植物防御病原真菌中起着重要作用［19］。这些研究多致力于挖掘抗性QTL，而QTL的鉴定依赖于群体标记密度以及表型鉴定的准确性。随着测序技术的发展，对标记的开发利用变得越来越便利快捷，而对表型进行精准鉴定成为QTL研究的重要环节。玉米穗腐病的发生具有不同的侵染途径，而且存在组织特异性，同时也是一种遗传力较低、易受环境影响的数量性状。将玉米对穗腐病抗性剖分为穗轴抗性和籽粒抗性，可从不同的角度加深对穗腐病抗性机制的认识。玉米穗轴对拟轮枝镰孢菌抗性指标的建立及抗病种质资源的筛选，有益于准确鉴定表型与筛选穗轴高抗穗腐病的自交系及品种，为穗轴抗性遗传研究过程中表型的准确鉴定提供保障。本研究组正在进行穗轴特异抗性QTL与候选基因的功能验证以及网络调控机制的研究，并通过候选基因的关联分析，挖掘优良等位变异及最优单倍型，深入解析玉米穗腐病穗轴抗性遗传机制，并为分子育种提供优异抗源、抗性基因以及功能标记，最终服务于玉米抗病育种工作。参考文献：［1］裴冬丽,刘春元,吴建宇,等.河南省玉米穗粒腐病病原串珠镰刀菌鉴定［J］.玉米科学，2011,19(1):136-138.PeiDL,LiuCY,WuJY,etal.TheIdentificationofPathogenFusariumVerticillioidesCausingMaizeEarRotinHenan[J].JournalofMaizeScience,2011,19(1):13-1638.(inChinese)[2]赵清爽，席靖豪,袁虹霞，等.不同杀菌剂对两种玉米穗粒腐病菌的室内毒力测定[C].中国植物病理学会2017年学术年会,2017:1.[3]陈捷.我国玉米穗、茎腐病病害研究现状与展望J],沈阳农业大学学报,2000,31(5):393-401.ChenJ.StatusandPerspectiveonResearchofEarRotandStalkRotinMaize[J].JournalofShenyangAgriculturalUniversity,2000,31(5):393-401.[4]盖晓彤.玉米茎腐病与穗腐病致病镰孢菌侵染途径及其致病力差异研究[口].沈阳农业大学,2018.[5]方胄,吴秀艳,杨英娟，等.玉米穗、茎腐病致病串珠镰孢菌的侵染循环关系研究J],杂粮作物2005,25(2):96-97.FangW,WuXY,YangYJ,etal.StudyontheInfectionCycleofPathogeneticF.moniliformeofMaizeEarRotandMaizeStalkRot[J].RainFedCrops,2005,25(2):96-97.(inChinese)[6]MillerSS,ReidLM,HarrisLJJCJOB.ColonizationofMaizeSilksbyFusariumgraminearum,theCausativeOrganismofGibberellaEarRot[J].CanadianJournalofBotany,2010,85(4):369-376.[7]DesjardinsAE,MaragosCM,ProctorRH,etal.MaizeEarRotandMoniliforminContaminationbyCrypticSpeciesofFusariumsubglutinans[J].JournalofAgriculturalandFoodChemistry,2006,54(19):7383-90.[8]OldenburgE,EllnerFJMR.DistributionofDiseaseSymptomsandMycotoxinsinMaizeEarsInfectedbyFusariumculmorumandFusariumgraminearum[J].MycotoxinResearch,2015,31(3):1-10.[9]MoralesL,ZilaCT,MoretaMejiaDE,etal.DiverseComponentsofResistancetoFusariumverticillioidesInfectionandFumonisinContaminationinFourMaizeRecombinantInbredFamilies[J].Toxins,2019,11(2):86.[10]MuC,GaoJ,ZhouZ,etal.GeneticanalysisofcobresistancetoF.verticillioides:anothersteptowardstheprotectionofmaizefromearrot[J].TheoreticalandAppliedGenetics,2019,132:1049-1059.[11]陈玉娜.玉米穗粒腐病主效抗病QTL分析及其抗性机理研究[口].河南农业大学,2014.[12]马秉元，李亚玲,龙书生，等.玉米穗粒腐病接种技术及品种抗病性鉴定[J].植物保护学报，1999,(02):121-124.MaBY,LiYL,LongSS,etal.InoculationTechniqueofCornKernelorEarRotandIdentificationofVarietyResistance[J].ActaPhytophylacicaSinica,1999,(02):121-124.(inChinese)[13]王丽娟，徐秀德，刘志恒，等.玉米抗镰刀菌穗腐病接种