基础生化第十章的生物合成

第1页，共57页，2023年，2月20日，星期四第一节DNA指导的RNA的合成一、转录的一般特点二、DNA指导的RNA聚合酶三、原核生物转录过程四、真核生物转录第2页，共57页，2023年，2月20日，星期四一、转录的一般特点不对称转录:一条为负链（模板链）；另一条不做模板的链叫正链（编码链）。2.转录不需要引物，最先被转录的通常是嘌呤核苷酸3.以4种NTP为原料，需要Mg2+4.转录需要模板、解链，链的延长方向也是5′→3′，也有忠实性，调控主要在起始阶段。第3页，共57页，2023年，2月20日，星期四5335模板链编码链编码链模板链结构基因转录方向转录方向不对称转录(asymmetrictranscription)a.在DNA分子双链上某一区段，一股链用作模板指导转录，另一股链不转录；b.模板链并非永远在同一条单链上。第4页，共57页，2023年，2月20日，星期四（一）原核生物RNA聚合酶

二、DNA指导的RNA聚合酶n1ATPn2CTPn3GTPn4UTPRNA聚合酶DNA模板RNA+（n1+n2+n3+n4)PPi特点:（1）只有5´→3´聚合酶活性，而无外切酶活性（2）可催化从头合成，不需引物（3）启动转录需识别启动子P557第5页，共57页，2023年，2月20日，星期四核心酶coreenzyme全酶

holoenzymea2bb'ws=a2bb'w+s

全酶核心酶

此外，每个RNA聚合酶还含有2个Zn离子。P558ωω大肠杆菌RNA聚合酶亚基组成：第6页，共57页，2023年，2月20日，星期四亚基基因亚基数目功能rpoA2识别启动子上游序列解开前方的DNA双螺旋、恢复后面的DNA双螺旋βrpoB1结合底物核苷酸催化磷酸二酯键的形成β'rpoC1与DNA的模板链结合σrpoD1识别启动子部位，促进转录起始ω1未知大肠杆菌RNA聚合酶各亚基的性质和功能催化中心第7页，共57页，2023年，2月20日，星期四第8页，共57页，2023年，2月20日，星期四多个通道：核苷酸入口；RNA出口；DNA入口第9页，共57页，2023年，2月20日，星期四（二）真核生物的RNA聚合酶功能分工种类分布转录产物相对活性α-鹅膏蕈碱敏感性对放线菌素D敏感性RNApolⅠ核仁28S,18S,5.8SrRNA50-70％不敏感非常RNApolⅡ核质hnRNA，SnRNA20-40％高度轻度RNApolⅢ核质tRNA，5SrRNA，SnRNA，ScRNA10％种特异性轻度环状八肽本身不能直接识别起点，需借助于转录因子P561第10页，共57页，2023年，2月20日，星期四转录起始需解决两个问题：RNA聚合酶必须准确地结合在转录模板的起始区域。DNA双链解开，使其中的一条链作为转录的模板。三、原核生物转录过程（一）转录起始P559第11页，共57页，2023年，2月20日，星期四DNA序列按正链RNA来书写。将在DNA上开始转录的第一个碱基定为+1，沿转录方向下游的核苷酸序列均用正值表示；上游的核苷酸序列均用负值表示。1.转录起点的确定启动子（Promoter）：RNA聚合酶能够识别、并与模板DNA结合而启动转录的DNA序列。约20-200个碱基的特定顺序。P561第12页，共57页，2023年，2月20日，星期四

××AGTCTTGACA××××××××××××××××××TAT××××××××××××××ATAAAT××××××AACTGT××××AAT××××××××××××××××Pribnow框-10-35识别区16-19bp5-9bp起点大肠杆菌启动子共有序列及其功能两个序列的高度保守，之间的距离也非常重要，将影响σ因子的作用，从而改变起始效率。P562第13页，共57页，2023年，2月20日，星期四ThenucleotidesequencesofrepresentativeE.colipromoters

-10区顺序：TATAAT一致性序列（Pribnowbox）是双螺旋解开的区域-35区顺序：TTGACA一致性序列,是RNA-pol对转录起始的识别位点

第14页，共57页，2023年，2月20日，星期四如何确定启动子的位置和序列？DNA足迹法（Foot-printing）P562第15页，共57页，2023年，2月20日，星期四σ因子识别并与启动子特异性结合（上游序列由α亚基识别）RNA聚合酶全酶结合到起始点，形成封闭型复合物-10区双链打开形成开放型复合物合成10个以上核苷酸的RNA链σ因子脱落，RNA聚合酶离开启动子，进入RNA链延伸阶段P559第16页，共57页，2023年，2月20日，星期四1）RNA聚合酶与dsDNA非特异结合（疏松），滑动扫描2）RNA聚合酶全酶与启动子-35区特异结合，形成封闭复合物（未解链）3）封闭复合物异构化，转变为开放复合物（解链形成转录泡）4）第一个磷酸二酯键形成（通常为嘌呤核苷酸）5）启动子清空（参入6-10nt后σ因子释放，RNA聚合酶离开）2.转录起始复合物的形成（限速）启动子强度不同，链延伸的速度平均50nt/ｓ聚合酶全酶上的σ因子能识别启动子，并识别有义链，从而使全酶定位到启动子部位。第17页，共57页，2023年，2月20日，星期四RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合第18页，共57页，2023年，2月20日，星期四σ因子识别并与启动子特异性结合（上游序列由α亚基识别）RNA聚合酶全酶结合到起始点，形成封闭型复合物-10区双链打开形成开放型复合物合成10个以上核苷酸的RNA链σ因子脱落，RNA聚合酶离开启动子，进入RNA链延伸阶段P559第19页，共57页，2023年，2月20日，星期四

当s因子从核心酶上脱落后，核心酶与DNA链的结合变得疏松，可以在模板链上滑动，方向为DNA模板链的3′→5′，同时将核苷酸逐个加到RNA链的3'-OH端，使RNA链以5′→3′方向延伸。（二）转录的延伸A型双螺旋第20页，共57页，2023年，2月20日，星期四RNApol转录复合物：酶-DNA-RNA：转录空泡RNADNA上的解螺旋区：在RNA链延伸的同时，RNA聚合酶继续解开它前方的DNA双螺旋，暴露出新的模板链，而后面被解开的两条DNA单链又重新形成双螺旋，DNA上的解螺旋区保持约17个碱基对的长度。（转录泡）第21页，共57页，2023年，2月20日，星期四终止子：DNA分子上终止转录的特殊信号。原核生物终止子都有一个回文序列，产生的RNA可形成茎环结构，可使RNA聚合酶减慢移动或暂停合成。NusA等因子：辅助RNA聚合酶识别终止子。如NusA因子促进其在终止子位置的停顿。（三）转录的终止P566第22页，共57页，2023年，2月20日，星期四1.依赖因子的转录终止（当终止信号较弱时）ρ因子5′3′Polymerase富含C的短的回文对称区P566第23页，共57页，2023年，2月20日，星期四ρ因子功能识别并与新生RNA5´结合ATP供能ρ因子沿新生RNA单链推进,遇到暂停的RNA聚合酶新生RNA单链从DNA模板上分离下来（1）识别结合富含C的RNA链（2）依赖于RNA的ATPase活性（3）RNA-DNA解螺旋酶活性第24页，共57页，2023年，2月20日，星期四转录方向TCGGGCGAGCCCGCCGCCCGAGCGGGCTAAAAAATTTTTT3´3´5´5´DNA模板链编码链2.不依赖ρ因子的终止子（主要方式，又称简单终止）反向重复序列3´5´AAAAAAUUUUUUCGCCCGAGCGGGCU5´TTTTTTDNA模板链编码链转录产物3´3´5´第25页，共57页，2023年，2月20日，星期四（1）DNA模板上有终止信号富含GC的回文结构转录出来的RNA自身互补形成发夹状结构（2）转录出来的RNA

3´尾端有≥4个U，RNA-DNA为弱键配对简单终止的序列特征5´pppG5335RNA-pol茎环结构使转录终止的机理RNAPol遇茎环结构发生停顿，诱导RNA聚合酶构象改变；密集A-U配对使DNA和RNA稳定性下降，转录复合物趋于解离，释放转录产物。第26页，共57页，2023年，2月20日，星期四起始双链DNA局部解开磷酸二酯键形成终止阶段解链区到达基因终点延长阶段53RNA启动子Promoter

终止子terminator5RNA聚合酶5353553离开第27页，共57页，2023年，2月20日，星期四真核细胞的转录比较复杂。1.真核基因的顺式作用元件（cis-actingelement）：即DNA上对基因表达有调节活性的特定序列，按其功能可分为：启动子、增强子（enhancer）和沉默子（silencer）等。对应三类RNA聚合酶，有三类启动子，RNA聚合酶Ⅱ的启动子序列多样。四、真核生物转录（了解）第28页，共57页，2023年，2月20日，星期四

TATA盒

CAAT盒

GC盒

增强子

顺式作用元件结构基因-GCGC---CAAT---TATA转录起始真核生物启动子保守序列第29页，共57页，2023年，2月20日，星期四TATA框是RNA聚合酶Ⅱ和转录因子形成前起始复合物的主要装配点。起始子（initiator，Inr）：转录起点TATAPyPyANTAPyPy+1Inr第30页，共57页，2023年，2月20日，星期四2.转录因子（transcriptionfactor，TF）：RNA聚合酶在启动子部位起始转录需要的辅助因子（蛋白质）。真核生物的转录，启动子由转录因子而不是RNA聚合酶识别。参与RNA聚合酶Ⅱ转录起始的转录因子数目众多，分为三类：通用转录因子（generaltranscriptionfactor，GTF）、上游因子、可诱导因子。第31页，共57页，2023年，2月20日，星期四参与RNA-polⅡ转录的TFⅡ

P564第32页，共57页，2023年，2月20日，星期四POL-ⅡTFⅡFⅡAⅡBRNA-PolⅡ催化转录的PIC（前起始复合物）的组装

Pol-ⅡTFⅡFⅡHⅡETBPTAFTFⅡD-ⅡA-ⅡB-DNA复合物TATAⅡAⅡBTBPTAFTATAⅡHⅡECTD-PPIC组装完成，TFⅡH使CTD磷酸化P564第33页，共57页，2023年，2月20日，星期四原核生物与真核生物转录的区别

原核生物真核生物

RNApol一种高度分工起始转录因子没有需要（各不同）启动子以外序列没有有且复杂转录产物多顺反子单顺反子场所转录与翻译偶联不偶联转录终止两种终止子不明确第34页，共57页，2023年，2月20日，星期四DNA复制转录原料dDNANTP模板完整两条链双向复制DNA区段一条链不对称转录引物RNA为引物不需要酶与蛋白因子9种酶和蛋白因子全酶校正功能有无（很有限）差错率10-9-10-1010-4-10-5原核生物复制与转录比较第35页，共57页，2023年，2月20日，星期四第二节转录后加工基因转录的直接产物是初级转录物，一般是无功能的，往往需经过结构和化学的变化（转录后加工）才会具有功能。转录后加工的方式有多种，但本质相同：是增减核苷酸或核苷酸的修饰。三种主要的RNA在原核和真核生物中的加工方式不完全相同。几个基本要点：即使同一RNA前体也可能有不同加工方式，产生几种产物，这是基因表达调控的一种手段。P570第36页，共57页，2023年，2月20日，星期四⑴真核细胞每种转录产物都是各种RNA的前身，必须在胞核内经过适当加工，使之变成具有活性的成熟RNA后，由胞核运至胞质才能执行翻译功能。⑵原核细胞mRNA不需加工，tRNA和rRNA需要加工。⑶mRNA前体加工复杂。真核细胞转录作用和翻译作用无论在空间上还是时间上都是彼此分开进行的。真核细胞与原核细胞转录产物后加工的比较：相同点：二者tRNA和rRNA加工相似不同点：第37页，共57页，2023年，2月20日，星期四一、原核生物RNA的转录后加工（一）原核生物mRNA前体加工原核生物mRNA一般不稳定，很少经历加工，多数是边转录、边翻译。唯一的加工作用是多顺反子mRNA在RNaseⅢ的催化下，裂解为单独的顺反子。（二）原核生物tRNA前体的加工原核生物tRNA初始转录本有三种P570原核生物基因表达调控的单位是操纵子，其转录物为多顺反子。第38页，共57页，2023年，2月20日，星期四（1）多数为多顺反子（3）由tRNA和rRNA串联组成（2）少数为单顺反子第39页，共57页，2023年，2月20日，星期四5’成熟酶多顺反子tRNA两个末端的加工识别加工部位的空间结构。由蛋白质和RNA组成（核酶）。FFP572第40页，共57页，2023年，2月20日，星期四P5723’成熟酶tRNA核苷酰转移酶第41页，共57页，2023年，2月20日，星期四（1）RNaseP切除E.coli前体tRNA5´的前导序列（41nt）。（2）去尾，形成3’-OH末端。由内切酶和外切酶（RNaseF和RNaseD）共同参与。（3）修饰。主要是碱基修饰，方式近百种，常见的如通过甲基化酶，硫醇酶，假尿嘧啶核苷化酶等的作用进行修饰成为特殊的碱基（4）加上CCA剪切修剪核苷酸修饰原核生物tRNA前体的加工第42页，共57页，2023年，2月20日，星期四碱基修饰（2）还原反应如：UDHU（3）核苷内的转位反应如：Uψ（4）脱氨反应如：AI如：AAm（1）甲基化（1）（1）（3）（2）（4）第43页，共57页，2023年，2月20日，星期四原核生物rRNA以多顺反子的形式存在，还可能带有某些tRNA的基因。E.coli中rRNA有7个转录单位,每个转录单位含有16S、23S、5SrRNA及一个或几个tRNA。rRNA前体的加工由RNaseⅢ等负责。tRNA（三）原核生物rRNA的加工P571第44页，共57页，2023年，2月20日，星期四1.剪切和修剪2.核苷酸的修饰（主要为核糖的甲基化，SAM作为供体）RNaseⅢ第45页，共57页，2023年，2月20日，星期四二、真核生物RNA的转录后加工（一）mRNA前体加工

真核生物转录生成的mRNA要经过较复杂的加工过程。包括：①5′末端加帽②3′端加尾③剪接④核苷酸编辑⑤甲基化修饰。

1.5′末端加帽

（1）帽子的种类P573第46页，共57页，2023年，2月20日，星期四图5-9帽子p161（1）帽子的种类第47页，共57页，2023年，2月20日，星期四（2）帽子的功能提高mRNA的稳定性；参与识别起始密码子；有利于mRNA从核到质的转移；5‘帽子结合蛋白涉及第一个内含子剪接复合物的形成，直接影响mRNA的剪接效率（3）加帽反应是共转录反应鸟苷酸转移酶pppG5′磷酸酶ppGpi5′+pppGGpppG5′+ppiSAM甲基转移酶第48页，共57页，2023年，2月20日，星期四2.3′加尾加尾信号长度变化尾巴功能：增加mRNA的稳定性；提高mRNA翻译效率；poly（A）可影响mRNA前体最后一个内含子的剪切，缺少poly（A）使剪接效率降低5-10倍。精确的剪切RNaseⅢ第49页，共57页，2023年，2月20日，星期四Eukaryotepre-mRNAsoftenhaveinterveningintronsthatmustberemovedduringRNAprocessingintron=non-codingDNAsequencesbetweenexonsinagene.exon=expressedDNAsequencesinagene,codeforaminoacids.1993:RichardRoberts(NewEnglandBiolabs)&PhillipSharp(MIT)3.剪接（去除内含子并连接外显子）

P575第50页，共57页，2023年，2月20日，星期四ElectronmicroscopyofanRNA-DNAhybridbetweenadenovirusDNAandthemRNAencodingthehexonprotein（P690）ModifiedfromPNAS1977,74:3171第51页，共57页，2023年，2月20日，星期四类型Ⅰ自我剪接（广泛，真核生物细胞器基因，低等真核生物核rRNA基因、细菌和噬菌体个别基因）类型Ⅱ自我剪接核mRNA剪接体的剪接（