基因突变重组与检测技术

基因突变重组与检测技术第1页，共72页，2023年，2月20日，星期四内容介绍二、基因重组技术三、基因突变的检测方法1.分子杂交技术3.高通量基因测序技术一、基因突变的产生与后果2.基因测序技术第2页，共72页，2023年，2月20日，星期四遗传中心法则回顾转录翻译逆转录DNARNA蛋白质复制第3页，共72页，2023年，2月20日，星期四第一节基因突变的产生与后果点突变基因缺失插入基因异位或重排表观遗传学基因突变的种类第4页，共72页，2023年，2月20日，星期四DNA分子中发生碱基对的替换、增添和缺失，而引起的基因序列的改变一、基因突变的定义┯┯┯┯

ＡＴＧＣ

ＴＡＣＧ

┷┷┷┷┯┯┯┯┯

ＡＴＡＧＣ

ＴＡＴＣＧ

┷┷┷┷┷┯┯┯┯

ＡＴＧＣ

ＴＡＣＧ

┷┷┷┷┯┯┯

ＡＧＣ

ＴＣＧ

┷┷┷┯┯┯┯

ＡＣＧＣ

ＴＧＣＧ

┷┷┷┷┯┯┯┯

ＡＴＧＣ

ＴＡＣＧ

┷┷┷┷增添缺失替换第5页，共72页，2023年，2月20日，星期四基因突变的原因和类型外界因素物理因素化学因素生物因素内部因素DNA修复功能减弱类型原因自然突变人工诱变第6页，共72页，2023年，2月20日，星期四基因突变的特点和意义意义：新基因产生的途径，是生物变异的根本来源，是生物进化的途径。特点普遍性:生物界中普遍存在随机性:可发生在生物个体发育任何时期不定向性：突变无明显偏倚低频性:自然状态下突变频率很低10－5-10-8多害少利性：多数有害,少数有利第7页，共72页，2023年，2月20日，星期四点突变的实例：镰刀型细胞贫血症的形成病人的血红蛋白的一条多肽链发生了什么变化？…－脯氨酸－谷氨酸－谷氨酸—……－脯氨酸－缬氨酸－谷氨酸—…正常异常第8页，共72页，2023年，2月20日，星期四CTTGAA谷氨酸缬氨酸DNAmRNA氨基酸蛋白质正常异常GUACATGTA突变GAA_____原因_____原因根本直接点突变的实例：镰刀型细胞贫血症第9页，共72页，2023年，2月20日，星期四与肿瘤相关的常见点突变类型基因生长因子Sis,α-TGF,生长因子受体Erb(EGFR),HER2/neu,细胞信号传导因子H-,K-,N-ras,src,raf,转录因子N-,c-,L-myc,c-jun,fos细胞周期因子PRAD1(cyclinD)凋亡相关基因bcl-2,bcl-X第10页，共72页，2023年，2月20日，星期四肿瘤突变—取样的特殊性注意事项：必须从肿瘤组织中取样SampleSelectionbyLaserCaptureMicrodissection第11页，共72页，2023年，2月20日，星期四基因缺失基因缺失可以是1-2个碱基，也可以是一个片段甚或一个外显子的缺失。基因片段的缺失可使该基因激活，转录异常，使基因正常的生物学功能丧失。在肿瘤发生中，多为抑癌基因的缺失。常见的抑癌基因缺失包括：RB-theretinoblastomagenp53genep16-INK4a第12页，共72页，2023年，2月20日，星期四基因插入基因插入多由病毒感染造成。病毒肿瘤人类T-淋巴细胞白血病病毒I型白血病人类巨细胞病毒（CMV）血液系统恶性肿瘤嗜肝DNA病毒肝癌人类乳头状瘤病毒（HPV）宫颈癌EB病毒（EBV）鼻咽癌第13页，共72页，2023年，2月20日，星期四基因异位与重排指细胞基因组中DNA顺序重新排列组合的现象

淋巴细胞白血病

t(9;22):BCR-ABL t(12;21):TEL-AML1 t(1;19):E2A-PBX1 t(4;11):MLL-AF4

髓细胞白血病

Inv(16):CBF-MYH11 t(8;22):AML-ETO t(9;22):BCR-ABL5'partnerClass3'partnerTMPRSS2IERGTMPRSS2IETV1TMPRSS2IETV4HERV-K_22q11.23IIETV1SLC45A3IIETV1C15orf21IIIETV1HNRPA2B1IVETV1KLK2IIETV4CANT1IIETV4ACSL3IIETV1SLC45A3IIERGFLJ35294IIETV1DDX5IVETV1TMPRSS2IETV5SLC45A3IIETV5EST14IIETV1HERVK17IIETV1ETV家族常见融合基因第14页，共72页，2023年，2月20日，星期四表观遗传学1.概念：基因的DNA序列不发生改变的情况下，基因的表达水平与功能发生改变，并产生可遗传的表型。2.特征:(1)可遗传；(2)可逆性；(3)DNA不变3.表观遗传学的现象：(1)DNA甲基化(2)组蛋白修饰(3)MicroRNA(4)Genomicimprinting(5)端粒酶第15页，共72页，2023年，2月20日，星期四表观遗传学——甲基化第16页，共72页，2023年，2月20日，星期四表观遗传学——组蛋白修饰组蛋白（去）乙酰化De/Acetylation组蛋白甲基化Methylation组蛋白磷酸化Phosphorylation组蛋白泛素化Ubiquitination组蛋白糖基化ADP-Rybosilation组蛋白与Swi/Snf复合体的结合Swi/Snfcomplex,which,invitro,usestheenergyofATPhydrolysistodisrupthistone-DNAinteractions多数化学修饰的化学基团可以减少组蛋白的正电性，从而使其与DNA结合变疏松，使染色质结构发生变化。第17页，共72页，2023年，2月20日，星期四表观遗传学——microRNA细胞核内转录后长片段的miRNA（Pri-miRNA)Drosha酶处理70－100个nt的发夹结构的RNA（pre-miRNA）运输到胞质Dicer剪切19－23个nt组成的成熟的miRNA结合到由RNA介导的RISC或类似相同的复合物中，参与RNA干扰，由miRNA和靶基因mRNA的碱基配对引导RISC降解目的片段或是阻碍其翻译过程第18页，共72页，2023年，2月20日，星期四表观遗传学——microRNA50％的miRNAs位于或靠近肿瘤中易发生改变的染色体区域内.常见的断裂位点，靠近或在可能的癌基因或抑癌基因范围内最小扩增区域，可能包含癌基因最小杂合子缺失区域，通常认为抑癌基因定位在这些区域中脆性位点（FRA),FRA是容易发生姐妹染色质交换，易位，缺失，扩增的位点，或者质粒DNA和肿瘤相关病毒易插入位点第19页，共72页，2023年，2月20日，星期四第二节基因重组技术

整合基因重组转化（自然）转导转座

质粒基因工程BAC（人工）YAC

基因重组第20页，共72页，2023年，2月20日，星期四基因重组—整合整合：

噬菌体感染大肠杆菌的第一步噬菌体粘附于细胞壁上，将自身的DNA注入菌体中。此DNA可与细菌染色体重组，成为细菌染色体的一部分。溶原菌：整合了噬菌体基因组的细菌。裂解：噬菌体感染大肠杆菌的第二步DNA利用菌体的酶系统，复制自身及外壳蛋白，组装成大量新噬菌体，并将细菌涨破。第21页，共72页，2023年，2月20日，星期四基因重组—转化转化：由外来DNA引起生物类型改变的过程称为转化。细菌的转化第22页，共72页，2023年，2月20日，星期四基因重组—转化病毒癌基因感染宿主细胞后，可整合到宿主染色体上，从而使宿主细胞癌变。转染：噬菌体感染宿主菌后，核酸进入菌体内的过程。第23页，共72页，2023年，2月20日，星期四基因重组—转导溶原菌中DNA可以原样地切离出来，也可以把邻近的宿主DNA在切离时带走一部分。后者称转导。带有宿主DNA的噬菌体称转导噬菌体。来源于宿主的基因称转导基因。第24页，共72页，2023年，2月20日，星期四基因重组—转位转位：一个或一组基因从一处转到基因组的另一个位置。这些游动的基因称为转位子(transposon)。第25页，共72页，2023年，2月20日，星期四基因工程技术酶目的基因载体基因宿主基本要素基因工程(geneticengineering)

——实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。第26页，共72页，2023年，2月20日，星期四质粒

(plasmid)特点能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。第27页，共72页，2023年，2月20日，星期四克隆载体(cloningvector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expressionvector)为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。载体第28页，共72页，2023年，2月20日，星期四目的基因1.化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。2.基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)3.cDNA文库(cDNAlibrary)4.聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)

（见第22章）第29页，共72页，2023年，2月20日，星期四重组DNA技术中常用的工具酶-限制性核酸内切酶定义限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ第30页，共72页，2023年，2月20日，星期四第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。命名HindⅢ

属

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶第31页，共72页，2023年，2月20日，星期四Ⅱ类酶识别序列特点——

回文结构(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG第32页，共72页，2023年，2月20日，星期四BamHⅠGATCTAGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGEcoRVGATATCCTATAGATCTAG+平端切口粘端切口第33页，共72页，2023年，2月20日，星期四不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接EcoRⅠ切割位点BglⅡ切割位点+EcoRⅠ+BglⅡ双酶切EcoRⅠ+BglⅡ双酶切T4

DNA连接酶15ºC重组体配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。第34页，共72页，2023年，2月20日，星期四重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源基因）基因组DNAcDNA人工合成PCR产物限制酶消化开环载体DNA目的基因连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体的宿主筛选表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交第35页，共72页，2023年，2月20日，星期四大肠杆菌表达系统酵母表达系统哺乳细胞表达系统几种不同的蛋白表达系统第36页，共72页，2023年，2月20日，星期四

重组DNA医药产品产品功能组织胞浆素原激活剂抗凝血液因子VIII促进凝血颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子剌激白细胞生成促红细胞生成素剌激白细胞生成生长因子(bFGF,EGF)刺激细胞生长与分化生长素治疗侏儒症胰岛素治疗糖尿病干扰素(1b,2a,2b,)抗病毒感染及某些肿瘤白细胞介素激活、剌激各类白细胞超氧化物歧化酶抗组织损伤单克隆抗体利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗乙肝疫苗(CHO,酵母)预防乙肝口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗预防霍乱目录第37页，共72页，2023年，2月20日，星期四酵母人工染色体

(yeastartificialchromosome,YAC)细菌人工染色体

(bacterialartificialchromosome,BAC)动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）其他第38页，共72页，2023年，2月20日，星期四人工染色体染色体要确保在细胞分裂中保持稳定，必须要能够自我复制和向子细胞中平均分配。它需要3个关键序列，包括自主复制DNA序列（autonomouslyreplicatingsequence，ARS）着丝粒DNA序列（centromereDNAsequence，CEN)端粒DNA序列（telomereDNAsequence,TEL）第39页，共72页，2023年，2月20日，星期四人工染色体

将3个关键序列用分子生物学方法拼接起来就得到人造微小染色体（artificialminichromosome），在大片段DNA分子的克隆、基因组分析、基因功能鉴定、基因治疗以及研究染色体结构与功能关系等研究中得到了广泛的应用，具有极为重要的价值。目前，正在研究或应用的有：酵母人工染色体(yeastartificialchromosome,YAC)细菌人工染色体（bacterialartificialchromosome,BAC）哺乳动物人工染色体(mammalianartificialchromosome)。第40页，共72页，2023年，2月20日，星期四酵母人工染色体(YeastArtificialChromosome,YAC)第41页，共72页，2023年，2月20日，星期四第三节基因突变的检测方法分子杂交技术FISHSouthernblotNorthernblot芯片杂交3.高通量基因测序技术2.基因测序技术化学降解测序Sanger测序第42页，共72页，2023年，2月20日，星期四前列腺癌细胞中TMPRSS2-ERG融合基因检测（FISH法）荧光原位杂交（FISH）第43页，共72页，2023年，2月20日，星期四Southern和Northernblot原理和应用第44页，共72页，2023年，2月20日，星期四Southern和Northernblot原理和应用第45页，共72页，2023年，2月20日，星期四基因芯片原理第46页，共72页，2023年，2月20日，星期四基因芯片原理Geneprobes（cDNA、DNA）substrate

Ready-to-usemicroarrayOligoprobesAGCTorarrayer第47页，共72页，2023年，2月20日，星期四基因芯片原理第48页，共72页，2023年，2月20日，星期四基因芯片原理第49页，共72页，2023年，2月20日，星期四基因芯片原理第50页，共72页，2023年，2月20日，星期四基因芯片原理第51页，共72页，2023年，2月20日，星期四基因芯片原理第52页，共72页，2023年，2月20日，星期四基因测序技术简介他们给DNA的测序带来了一场革命，分享了1980年的诺贝尔化学奖。后来Sanger法发展为自动化测序法，并为人类基因组测序做出了卓越贡献。FredSanger

发明的末端合成终止法(sanger法)WalterGilbert发明的化学裂解法

Maxam-Gillbert法第53页，共72页，2023年，2月20日，星期四Maxam-Gilbert化学裂解法一个末端标记的DNA片段在几组互相独立的的化学反应分别得到部分降解，其中每一组反应特异地针对某一种或某一类碱基。因此生成一系列放射性标记的分子，从共同起点（放射性标记末端）延续到发生化学降解的位点。每组混合物中均含有长短不一的DNA分子，其长度取决于该组反应所针对的碱基在原DNA全片段上的位置。此后，各组均通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，再通过放射自显影来检测末端标记的分子。第54页，共72页，2023年，2月20日，星期四基因测序技术简介G反应：DMS使G在中性和高温条件下脱落。G+A反应：酸性条件（如甲酸）可使A和G嘌呤环上的N原子质子化，利用哌啶使A、G脱落。T+C反应：肼（低盐）C反应：肼（高盐）测定DNA长度~250bp。碱基特异性化学切割反应：硫酸二甲酯（DMS）：使DNA分子中鸟嘌呤（G）上的N7原子甲基化。肼：使DNA分子中胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）的嘧啶环断裂；但高盐条件下，只C断裂，而不与T反应。哌啶：从修饰甲基处断裂核苷酸链。在不同的酸、碱、高盐和低盐条件下，三种化学试剂按不同组合可以特异地切割核苷酸序列中特定的碱基。第55页，共72页，2023年，2月20日，星期四Maxam-Gilbert化学裂解法第56页，共72页，2023年，2月20日，星期四末端合成终止法(sanger法)原理2‘,3’-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）与普通dNTP不同之处在于其脱氧核糖的3‘位置少一个羟基，可在DNA聚合酶作用下通过其5'三磷酸基团掺入到正在增长的DNA链中，但ddNTP因缺乏3‘羟基而不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，因此，当正在增长的DNA链末端碱基为ddNTP时，则链延伸反应终止，不可能继续延伸。这样，在DNA合成反应混合物的4种普通dNTP中加入少量的一种ddNTP后，链延伸将与偶然发生却十分特异的链终止展开竞争，反应产物是一系列的核苷酸链，其长度取决于从用以起始DNA合成引物末端到出现过早链终止的位置之间的距离，结果将产生4类寡核苷酸，它们分别终止于模板链的每一个A、C、G或T的位置上。第57页，共72页，2023年，2月20日，星期四末端合成终止法(sanger法)原理双脱氧链终止法的测序基础是以双脱氧苷三磷酸为循环测序反应的链终止剂。第58页，共72页，2023年，2月20日，星期四末端合成终止法(sanger法)原理POHdNTPddNTPPOHOHPPPPOH第59页，共72页，2023年，2月20日，星期四末端合成终止法(sanger法)原理5’3’5’