微生物菌种制备原理与技术

微生物菌种制备原理与技术第1页/共66页发酵工业微生物菌种发酵微生物生理学微生物菌种选育微生物原生质体育种与基因组改造工业微生物的系统生物学与合成生物学第2页/共66页微生物的类群

目前已经知道的微生物有10万中之多，主要分布在下列类群中：原核生物界：细菌、蓝藻（无膜围的核和其他细胞器，不构成染色体）真菌界：霉菌、酵母菌、蘑菇（真核生物，不含叶绿体）原生生物界：草履虫、变形虫（最简单的真核生物，生存于水中，有的有叶绿体）病毒：艾滋病毒、脊髓灰质炎病毒第3页/共66页真菌原生生物酵母菌第4页/共66页微生物的特点：1.微生物的比表面积非常大。

迅速摄取所需各种营养物质，维持极高的生长繁殖速度和很高的生物合成活动2.代谢反应具有多样性。

次级代谢为人类提供无穷无尽的次级代谢产物3.容易适应多种环境。

可以把菌种从自然界转种到实验室或工业生产，进行人工培养，在廉价的碳源、氮源条件下合成若干中有价值的代谢产物第5页/共66页工业微生物发酵的重要经济产品：1.微生物细胞2.微生物生命活动过程中产生的大分子化合物：酶、多糖、核酸、蛋白质等3.微生物代谢的转化产物：低级醇、有机酸4.微生物产生的初级和次级代谢产物:氨基酸、核苷酸、抗生素、生物碱、毒素、色素等第6页/共66页第一节发酵工业微生物菌种一.概述在微生物工业应用中，微生物菌种工作主要包括：菌种的分离筛选菌种培育菌种的保藏退化菌种的复壮第7页/共66页1、细菌单细胞原核生物，自然界中分布最广、数量最多繁殖方式：无性二等分分裂法产品：氨基酸、核苷酸、多糖、酶、有机酸工业常用枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、乳酸乳杆菌、谷氨酸棒状杆菌二、发酵工业常用微生物种类第8页/共66页形态球状杆状螺旋状第9页/共66页菌落定义：单个或者少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，会形成一个肉眼可见的、具有一定形态结构的子细胞群体，也称群落。特征：大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等。功能：每种细菌在一定条件下所形成的菌落，可以作为菌种鉴定的重要依据。第10页/共66页几种菌落第11页/共66页2、放线菌概述：具有菌丝，主要以孢子繁殖，革兰氏染色阳性的一类原核微生物。分布：含水量较低、有机质丰富和呈碱性土壤中。结构：营养菌丝、气生菌丝、孢子丝。繁殖：无性孢子，菌丝片段（液体）、孢子囊第12页/共66页菌落特征：质地密，表面呈紧实的绒状或坚实、干燥、多皱褶、菌落小而不蔓延产品：抗生素工业菌种：变铅链霉菌、天蓝色链霉菌、铁锈游动放线菌第13页/共66页3、酵母概述：腐生类真核生物，单细胞，卵圆形或圆柱形分布：含糖丰富而偏酸环境繁殖方式：无性生殖和有性生殖菌落：多为乳白色，少数黄色、红色、黑色产品：酒精、有机酸、单细胞蛋白工业常用：酿酒酵母、光滑假丝酵母、热带假丝酵母第14页/共66页4、霉菌概述：丝状真菌分布：土壤、水域、空气及动植物体外繁殖方式：无性孢子和有性孢子生长方式：菌丝末端的生长和顶端分支，彼此交错呈网状。菌落：菌丝粗长、疏松、绒毛状、大工业用：青霉、曲霉、毛霉、木霉等青霉第15页/共66页红曲霉木霉青霉毛霉第16页/共66页发酵产品是高浓度、高转化率和高产率的，菌株应为分泌型；菌株能利用常用的碳源，并可连续培养菌株是非致病的，不产生内毒素；发酵所产生的热量和需氧量低，发酵温度适当；代谢控制容易进行；能进行适当的重组DNA，并且重组稳定。抗噬菌体和杂菌污染的能力强三、发酵工业为对微生物的基本要求第17页/共66页四、菌种的制备原理与方法在微生物工业应用中，微生物菌种工作主要包括：菌种的分离筛选：挑选符合生产要求的菌种，这是选种工作的任务。菌种培育：改良已有菌种的生产性能，使产品的质和量不断提高，或使它更适应于工艺的要求，这是育种工作的任务。菌种的保藏：一切生产菌种都要使它避免死亡和生产性能的下降，这是菌种保藏工作的任务。退化菌种的复壮：如果发现菌种的生产性能下降，就要设法使它恢复，这便是菌种复壮工作的任务第18页/共66页工业微生物获得途径向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株由自然界采集样品，从中进行分离筛选从一些发酵制品中分离目的菌株第19页/共66页从自然界分离筛选微生物的方法含微生物样品的采集一般土壤采集，注意有机质含量、通气情况、酸碱度、植被情况等含微生物样品的富集培养控制培养基营养成分；控制培养条件；抑制不需要的菌类微生物的分离稀释涂布和划线分离法利用平皿中生化反应（透明圈、变色圈、生长圈、抑菌圈）组织分离法通过控制营养和培养条件分离野生型目的菌株的筛选初筛、复筛野生型目的菌株的菌种鉴定第20页/共66页五、适应性进化

定义：又称菌种驯化，一般指通过人工措施使微生物逐步适应某一条件，而定向选育微生物的方法结果：获得较高耐受力及活动能力的菌株第21页/共66页六、菌种的保藏1.菌种的退化和防止2.菌种的复壮3.工业微生物菌种的保藏第22页/共66页1.菌种的退化和防止菌种退化定义：生产菌种或选育过程中筛选出来的较优良菌株，由于进行移接传代或保藏之后，群体中某些生理特征和形态特征逐渐减退或完全丧失的现象表现：生长速度变慢、目的代谢产物合成变慢原因：菌种遗传特性改变

菌种生理特性改变第23页/共66页菌种遗传特性的改变异核现象—导致菌种这一微生物群体发生变异自发突变—导致菌种遗传特性改变回复突变或产生分离子—形成具有不同基因型的个体异核体孢子遗传特性和生长速度不同菌种遗传特性发生改变相邻菌丝细胞吻合第24页/共66页回复突变（reversemutation)：突变体经过第二次突变又完全或部分地恢复为原来的基因型或表型。真正回复突变：完全修正碱基序列。第二位点突变：第二次突变发生在另一部位上,其结果是部分恢复原来的表型。第25页/共66页菌种生理状态的改变主要是因为培养条件不适当。一个菌种不是纯一的群体培养基营养成分的影响不同的培养条件下，某些基因所处的状态（活化）不同，使得菌种的生理状态不同。第26页/共66页防止菌种退化的方法尽量减少传代经常对菌种进行纯化创造良好的培养条件用单核细胞移植传代采用有效的菌种保藏方法第27页/共66页2.菌种的复壮定义：指对已衰退的菌种进行纯种分离和选择性培养，使其中未衰退的个体获得大量繁殖，重新成为纯种群体的措施。方法纯种分离淘汰已衰退的个体宿主体内复壮法（寄生性微生物）第28页/共66页3.工业微生物菌种的保藏定义在广泛收集实验室和生产菌种的基础上，将其妥善保藏，使之达到不死、不衰、不污染，以便于研究、交换和使用的目的。原理挑选典型菌种的优良纯种，采用其休眠体创造适合其长期休眠的环境条件第29页/共66页3.工业微生物菌种的保藏方法斜面低温保藏法液体石蜡油保藏法砂土管保藏法冷冻干燥保藏法液氮超低温保藏法

第30页/共66页斜面低温保藏法将微生物在适宜的斜面培养基和温度条件下培养并生长良好后，放入4-5℃冰箱中保藏。1）影响因素：菌种保藏培养基和培养条件2）适用菌：细菌、放线菌、酵母、丝状真菌3）缺点：易使菌株发生自发突变，引起菌种的退化甚至死亡4）保存期：1-3个月。第31页/共66页液体石蜡油保藏法

斜面保藏的一种方式，斜面中加入石蜡油，可防止培养基水分蒸发并隔绝氧气1）适用菌：在固体培养基上不能形成孢子的丝状担子菌2）保存期：1年第32页/共66页砂土管保藏法1）方法：砂和土的比例一般为3：2或1：1将要保存的菌种斜面孢子刮下，直接与砂土混合或制成悬浮液，放在干燥低温环境下保存。2）原理：造成干燥和寡营养的保藏条件3）适用菌：产孢子的放线菌4）保存期：1年以上。

第33页/共66页冷冻干燥法1）方法将菌种制成悬浮液，与保护剂(一般为脱脂牛奶或血清等)混合，用低温酒精或干冰(－15℃以下)速冻，用真空泵抽干，最后真空密封，低温保存。2）范围：大多数微生物3）优点：菌种不易发生变异4）保存期：5-10年第34页/共66页液氮超低温保藏法1）方法：菌种加10％保护剂（甘油、二甲基亚砜），以1℃/min速度降温到-35℃，置于液氮气相中（-196℃）保藏。2）优点：防止菌种退化最有效的方法3）适用菌：适用于各种微生物保藏3）保存期：永久。第35页/共66页菌种保藏注意事项菌种保藏前所处状态（休眠体，如孢子芽孢）。菌种保藏所用的基质操作过程对细胞结构的损害工程菌的保藏常用宿主：大肠杆菌和毕赤酵母常用方法：甘油（15%）和菌悬液混匀后-80℃冰箱保存

第36页/共66页第二节发酵微生物生理学一、概述研究范围微生物细胞的结构与功能（营养物质吸收、能量消耗）微生物的生长与环境（微生物与环境的关系）微生物的代谢调控（代谢途径、调控方式等）第37页/共66页二、微生物的生长与繁殖细胞生长当代谢过程中同化作用的速度超过异化作用时，细胞的原生质总量就不断增加。细胞繁殖微生物生长到一定阶段，由于细胞分裂而出现细胞个体数目的增加。第38页/共66页三、底物的吸收与转运

1.影响物质运输的因素微生物的表面结构微生物的生存环境物质本身特性

2.营养物质的跨膜运输简单扩散促进扩散主动运输基团移位第39页/共66页1.次级代谢与初级代谢的关系概念初级代谢：在微生物的新陈代谢中，一般将微生物从外界吸收各种营养物质，通过分解代谢和合成代谢，生成维持生命活动的物质和能量的过程。次级代谢：是相对与初级代谢而提出的一个概念，指微生物在一定的生长时期，以初级代谢产物为前体，合成一些对微生物的生命活动没有明确功能的物质的过程。四、微生物生物合成的主要调控机制第40页/共66页代谢产物初级代谢产物：单糖或单糖衍生物、核苷酸、维生素、氨基酸、脂肪酸等，还有由它们组成的各种大分子聚合物，如蛋白质、核酸、多糖、脂质等生命必需物质。次级代谢产物：由初级代谢产物和中间体形成，分子结构比较复杂，根据其作用可分为抗生素、激素、生物碱、毒素等，通常分泌到胞外。分叉中间体：菌体代谢过程中产生的某些中间产物，即可用于合成初级代谢产物，又可用于合成次级代谢产物。第41页/共66页微生物生长曲线图次级代谢产物初级代谢产物第42页/共66页存在范围不同初级代谢的代谢系统、途径、产物在各类生物中都基本相同，它是普遍存在的基本代谢类型。次级代谢只存在于某些生物中，具有种属特异性。功能不同初级代谢：能使营养物质转化为结构物质、具生理活性物质或为生长提供能量，是机体生存必不可少的物质，在这些物质的合成过程的任何环节发生障碍，或者导致生长停止或死亡，是最基本的代谢。次级代谢：对菌体自身的生命活动无明确功能，不参与细胞结构组成，也不是酶活性必需的，也不是机体生长和繁殖所必需的物质。第43页/共66页合成时期不同初级代谢：自始自终存在与菌体中，同菌体的生长过程呈平行关系，只有微生物大量生长，才能积累大量初级代谢产物。次级代谢：是菌体生长至对数生长末期或稳定期产生的，它与机体的生长不呈平行关系。第44页/共66页对环境的稳定性不同初级代谢对环境条件变化的敏感性小，遗传稳定性大次级代谢对环境变化敏感，产物合成往往因环境条件变化而停止第45页/共66页1）代谢途经上：分叉中间体2）酶学关系上：催化次级代谢途径中各步反应的酶，既有初级代谢途径中的酶，又有次级代谢特有的酶3）代谢调节上：初级代谢受菌体调控更为严格，某些初级代谢产物对次级代谢有一定程度的调节作用初级代谢与次级代谢的联系第46页/共66页调控类型：酶的活性调节酶的合成调节能荷调节关系：协调进行2、初级代谢产物生物合成中的主要调控机制第47页/共66页1）酶活性的调节

通过改变已有酶的活性来调节代谢速率。酶活性的激活：前体激活，多发生在分解代谢途径，既代谢途经中后面的反应可被该途径较前面的一种代谢中间产物所促进。酶活性的抑制：包括竞争性抑制和反馈抑制（正反馈/负反馈）。

反馈抑制指反应途径中某些中间产物或末端产物对该途径中前面反应的影响协同反馈抑制作用机制累积反馈抑制增效反馈抑制顺序反馈抑制第48页/共66页协同反馈抑制

分支途径的几种末端产物同时过量时才抑制共同途径中的第一个酶活性。第49页/共66页黄色短杆菌的代谢过程天冬氨酸甲硫氨酸苏氨酸赖氨酸中间产物Ⅰ天冬氨酸激酶中间产物Ⅱ抑制高丝氨酸高丝氨酸脱氢酶第50页/共66页累积反馈抑制

每一种末端产物按一定百分率单独抑制共同途径中的第一个酶活性。第51页/共66页第52页/共66页增效反馈抑制

代谢途径中任何一种末端产物过量时，仅部分抑制共同反应途径中的第一个酶活性；但两个末端产物同时过量时，其抑制作用可超过各产物存在的抑制能力的总和。磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶6-氨基嘌呤核苷酸6-酮基嘌呤核苷酸第53页/共66页顺序反馈抑制

每个分支末端产物抑制分支后的第一个酶，产生部分抑制作用。第54页/共66页2）酶合成的调节

通过调节酶合成数量来调节微生物的代谢速率。酶合成的诱导根据酶合成与底物的关系分为：组成酶和诱导酶组成酶：是细胞固有的酶，合成受相应基因控制，与底物、底物类似物及环境条件无关，主要用于调节初级代谢。诱导酶：一些酶只有在它们催化的底物(或底物的结构类似物)存在时才能合成，此种酶称为诱导酶。能促进诱导酶产生的物质为诱导物。底物、底物结构类似物及底物前体都可作为诱导物。底物类似物是出色的诱导物，它可使酶的合成数量成倍或几十倍的增加，但他们不能充作底物。第55页/共66页酶合成的阻遏终产物反馈阻遏定义：代谢的终产物达到一定浓度时，反馈阻遏该代谢途径中的一种酶或几种酶的生物合成。（生物合成途径之中）

有两种或两种以上末端产物的分支途径中，当分支途径中的几种末端产物同时过量就反馈阻遏其共同途径中的第一个酶的合成，仅一种产物过量无阻遏作用，称为多价阻遏。分解产物反馈阻遏定义：被菌体迅速利用的底物或其分解产物对酶合成的抑制作用。单价阻遏多价阻遏终产物阻遏分解产物阻遏反馈阻遏碳分解产物阻遏氮分解产物阻遏第56页/共66页两种酶调节方式的对比酶合成的调节酶活性的调节不同点调节对象通过酶量的变化控制代谢速率控制酶活性，不涉及酶量变化调节效果相对缓慢快速、精细调节机制基因水平调节，调节控制酶合成代谢调节，调节酶活性相同点细胞内两种方式同时存在，密切配合，高效、准确控制代谢的正常进行。第57页/共66页3）能荷调节能荷：细胞中ATP、ADP、AMP系统中可供利用的高能磷酸键的量度；能荷调节（腺苷酸调节）：细胞通过改变ATP、ADP、AMP三者比例来调节其代谢活动。

当能荷在0.75以上时，ATP合成受到抑制，合成ATP的酶活性急速下降，而消耗ATP的酶活性急速上升。两系统在0.85处交叉，表明此时两种酶系达到平衡。这种现象存在与许多生长状态的细胞中。第58页/共66页3、次级代谢产物生物合成中的主要调控机制酶合成的诱导调节反馈调节磷酸盐调节ATP调节碳分解产物的调节氮分解产物的调节产生菌生长速率的调节第59页/共66页1）酶合成的诱导调节次级代谢途径中的某些酶是诱导酶，是在底物（或底物的结构类似物）的作用下，诱导酶的合成。外源诱导剂

诱导剂内源诱导剂第60页/共66页2）反馈调节

次级代谢产物的自身反馈抑制青霉素、链霉素、卡那霉素等多种次级代谢产物能调节自身的生物合成，其反馈机制只有少数品种比较清楚，如卡那霉素生物合成中，卡那霉素能反馈抑制合成途经中最后一步反应的酶N-乙酰卡那霉素酰基转移酶的活性。前体物质的自身反馈抑制次级代谢产物都是从初级代谢产物衍生来的，合成次级代谢产物的前体的自身反馈抑制，必然影响次级代谢产物的合成，如缬氨酸是合成青霉素的前体物质，它能自身反馈抑制合成途经中的第一个酶乙酰羟酸合成酶的活性，控制自身的生物合成，从而影响青霉素的合成