培养基的制备课件

第三章培养基的制备主要内容第一节、培养基的类型及功能第二节、工业发酵培养基第三节、淀粉水解糖的制备第四节、其他原料一、培养基的类型和用途二、培养基的选择三、培养基的配制原则四、培养基成分配比的选择培养基：是提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的、按一定比例配制的多种营养物质的混合物。发酵培养基的作用：满足菌体的生长促进产物的形成第一节培养基的类型及功能按物理状态不同划分固体培养基液体培养基在液体培养基中加入一定量凝固剂，使其成为固体状态，琼脂含量一般为1.5%-2.0%琼脂含量一般为0.2%-0.7%不加任何凝固剂半固体培养基固体培养基常用来进行微生物的分离、鉴定、活菌计数及菌种保藏

观察微生物的运动特征、分类鉴定及噬菌体效价滴定

大规模工业生产及在实验室进行微生物的基础理论和应用方面的研究按使用目的不同划分基础培养基鉴别培养基含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来的培养基用于鉴别不同类型微生物的培养基选择培养基在基础培养基中加入某些特殊营养物质制成的一类营养丰富的培养基微生物产生某种代谢产物，与培养基中的特殊化学物质发生特定的化学反应，产生明显的特征变化牛肉膏蛋白胨培养基是最常用的基础培养基加富培养基特殊营养物质包括血液、血清、酵母浸膏、动植物组织液等在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质，抑制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物的生长按用途不同划分孢子培养基发酵培养基是供制备孢子用的培养基

种子培养基满足菌种生长的培养基

满足大生产中大量菌体生长和繁殖以及代谢产物积累的营养基质

特点：1.富含有机氮源，少含或不含糖分。有机氮有利于菌体的生长繁殖，能获得更多的细胞。2.对于放线菌或霉菌的产孢子培养基，则氮源和碳源均不宜太丰富，否则容易长菌丝而较少形成孢子。3.斜面培养基中宜加少量无机盐类，供给必要的生长因子和微量元素。种子培养基(包括摇瓶种子和小罐种子培养基)：

培养种子的目的：1.扩大培养，增加细胞数量；同时也必须培养出强壮、健康、活性高的细胞。为了使细胞迅速进行分裂或菌丝快速生长。种子培养基特点：1.必须有较完全和丰富的营养物质，特别需要充足的氮源和生长因子。2.种子培养基中各种营养物质的浓度不必太高。供孢子发芽生长用的种子培养基，可添加一些易被吸收利用的碳源和氮源。3.种子培养基成分还应考虑与发酵培养基的主要成分相近。二、发酵培养基选择的依据

根据微生物的特点选择培养基细菌、酵母菌、霉菌、放线菌四类根据发酵方式选择培养基从生产实践和科学试验的不同要求选择从经济效益方面考虑选择培养基(1)必须提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分。(2)有利于减少培养基原料的单耗，即提高单位营养物质所合成产物数量或最大产率。(3)有利于提高培养基和产物的浓度，以提高单位容积发酵罐的生产能力。(4)有利于提高产物的合成速度，缩短发酵周期。(5)尽量减少副产物的形成，便于产物的分离纯化。(6)原料价格低廉，质量稳定，取材容易。7)所用原料尽可能减少对发酵过程中通气搅拌的影响，利于提高氧的利用率，降低能耗。(8)有利于产品的分离纯化，并尽可能减少产生“三废”的物质。三、发酵培养基的配制原则

根据不同微生物的营养需要营养成分的恰当比例渗透压pH值氧化还原电位注意的几个问题。四、培养基成分配比的选择培养基的组分、配比、缓冲能力、黏度、消毒是否彻底、消毒后营养破坏的程度及原料中杂质的含量都对菌体生长和产物形成有影响。理论+经验数学分析方法正交实验设计，方差分析因素水平玉米粉（％）A豆饼粉（％）B蛋白胨（％）CPH

D10.540.55.021.050.65.531.560.76.0正交表因素水平第一节、培养基的类型及功能第二节、工业发酵培养基第三节、淀粉水解糖的制备第四节、其他原料一、培养基的类型和用途二、培养基的选择三、培养基的配制原则四、培养基成分配比的选择一、工业上常用的碳源二、工业上常用的氮源三、无机盐四、生长因子五、前体物质和促进剂碳源：供给菌体生命活动所需的能量和构成菌体细胞以及代谢产物的基础。有糖类、脂肪、某些有机酸等等。氮源：主要构成菌体细胞物质和代谢产物，即蛋白质、氨基酸等之类的含氮代谢物。可分为有机氮源和无机氮源。功能：构成菌体成分；作为酶的组成分或维持酶的活性；调节渗透压、PH值、氧化还原电位等。无机盐：铅、镁、硫、磷、钾、钠、氯、锌、钴、锰。特殊生长因子：其功能是构成辅酶的组成分，促进生命活动的进行。如生物素、硫胺素、肌醇等，但需要量是极少的。水：体内各种生化作用必须在水溶液中进行。营养物质必须溶解于水中，才能透过细胞膜被微生物利用。诱导剂、前体和促进剂：胞外酶合成需要诱导物。一、工业上常用的碳源1、作用提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源和合成菌体所必需的碳成分

提供合成目的产物所必须的碳成分2、来源糖类、油脂、有机酸、正烷烃③淀粉、糊精使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类缺点：难利用、发酵液比较稠、一般>2.0%时加入一定的α-淀粉酶成分比较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等等。优点：来源广泛、价格底难利用，可以解除葡萄糖效应李江华，无锡轻工大学学报，2004(半纤维素酶)(1.5g麸皮)二、氮源

氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、核酸等）和含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类：有机氮源和无机氮源。

1、无机氮源种类：氨盐、硝酸盐和氨水特点：微生物对它们的吸收快，所以也称之谓迅速利用的氮源。但无机氮源的迅速利用常会引起pH的变化如：(NH4)2SO4

→2NH3+2H2SO4

NaNO3+4H2

→NH3+2H2O+NaOH

无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质，如硫酸胺，若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，如硝酸钠。正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的pH有积极作用。所以选择合适的无机氮源有两层意义：

满足菌体生长稳定和调节发酵过程中的pH2、有机氮源来源：工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟。成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机盐及生长因子。例玉米浆：①可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸②较多的乳酸③硫、磷、微量元素等培养基成分用量的多少大部分根据经验而来。但对于主产物代谢途径清楚的物质如酒精，可通过物料平衡计算加以确定。对于次级代谢产物，生物合成途径了解有限，根据化学计算比较困难，但也有人根据物料平衡计算了碳源转化为青霉素的得率。培养基在大规模生产中用量很大，在选用时应尽量地利用较丰富的廉价原料，设法降低成本。例如，赖氨酸（lys）生产中用山芋淀粉，后改为用山芋粉为碳源，这样不仅价廉，而且山芋粉中还含有生物素、镁盐等；省去了原来所加的玉米浆、硫酸镁，并使整个成本降低15%。用于生产疫苗的培养基，通常是用牛血清蛋白、牛肉汁等蛋白质作为碳源。三、无机盐1、作用：各种不一样2、来源：C、N源，以盐的形式补充3、用量：根据具体的产品，以实验决定4、使用注意点A.对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和微量元素在发酵过程中必须加以考虑.B、使用时注意盐的形式（pH的变化）例：黑曲酶NRRL-330,生产α-淀粉酶，P对酶活的影响pH酶活不加4.25120分钟加K2HPO45.4530分钟加KH2PO44.6275分钟１、磷酸盐磷是某些蛋白质和核酸的组成成分。工业上常用K3PO4.3H20、K3PO4和Na2HPO4.12H2O、NaH2PO4.2H2O等磷酸盐，也可用磷酸（使用时应先用NaOH或KOH中和后加入）。玉米浆、糖蜜、淀粉水解糖等原料中还有少量的磷。２、硫酸镁镁是某些细菌的叶绿素的组成成分。虽不参加任何细胞结构物质的组成，但它的离子状态是许多重要的酶的激活剂。硫，含硫蛋白质的组分；酶的活性基。硫酸镁２、钾盐钾不参加细胞结构物质的组成，但它是许多酶的激活剂。３、微量元素铜、锰、锌、钼、碘、溴等。避免有害离子加入到培养基中。四、生长因子

从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。

提供生长因子的农副产品原料：（1）玉米浆：玉米浆是用亚硫酸浸泡玉米而得的浸泡液的浓缩物，也是玉米淀粉生产的副产品。一般用量为0.4－0.8%。（2）麸皮水解液：可以代替玉米浆，但蛋白质、氨基酸等营养成分比玉米浆少。用量一般为1%（干麸皮计）左右。（3）糖蜜

前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接在生物合成过程中合成到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。五、前体物质和促进剂青霉素：分子量356苯乙酸:分子量136１、前体在抗生素发酵中大多数的前体物质对生产菌体有毒，故一次加入量不宜过大。苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07%。为避免前体物质浓度过大，一般采取间隙分批添加或连续滴加的方法加入。

所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。

２、产物促进剂

促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方面的。有些促进剂本身是酶的诱导物；有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产，也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用；有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。

在发酵过程中添加促进剂的用量极微，选择得好，效果较显著，但一般来说，促进剂的专一性强，往往不能相互套用。

能产生抑制作用的物质。

3、抑制剂在发酵过程中加入某些抑制剂会抑制某些代谢途径的进行，同时会使另一个代谢途径活跃，从而获得人们所需的某种产物或使正常代谢的某一中间物积累起来。抑制剂对代谢的抑制作用是发生在代谢链分枝代谢途径上。e.g.（1）四环素发酵过程中，添加NaBr,可以抑制金霉素的生物合成，从而提高四环素的产率。（2）头孢霉素C，添加L—Met，可以抑制头孢霉素N的生物合成，从而提高头孢霉素C的产率。几个发酵培养基例子

代谢产物培养基衣康酸甘蔗糖蜜，150g/L；ZnSO4，1.0g/L；MgSO4，3.0g/L；CuSO4，0.01g/L赤霉素葡萄糖，20g/L；MgSO4，1.0g/L；NH4NO3，1.0g/L；KH2PO4，5.0g/L；FeSO4·7H2O，0.01g/L；MnSO4·4H2O，0.01g/L；ZnSO4·7H2O，0.01g/L；CuSO45H2O，0.01g/L；玉米浆（干固形物），7.5g/L核黄素大豆油，20mL/L；甘油，20mL/L；葡萄糖，20g/L；玉米浆，12mL/L；酪蛋白，12g/L；KH2PO4，1.0g/L青霉素葡萄糖或糖蜜，总量的10%；玉米浆，总量的4%－5%；苯乙酸，总量的0.5%－0.8%；猪油或植物油、消泡剂，总量的0.5%第一节、培养基的类型及功能第二节、工业发酵培养基第三节、淀粉水解糖的制备第四节、其他原料一、工业上常用的碳源二、工业上常用的氮源三、无机盐四、生长因子五、前体物质和促进剂一、淀粉水解糖的制备方法二、淀粉酸水解原理三、淀粉酸水解工艺四、双酶水解法制糖五、水解糖液的质量要求

许多微生物由于其本身的生理生化特性而决定了其代谢所需的底物只能使葡萄糖等单糖，主要有下列菌种：酵母：G、F、蔗糖、半乳糖、以及部分麦芽糖等大部分的细菌：GA（没食子酸）产生菌、Lys产生菌、苏云金芽孢杆菌等；其中：地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌则可以以淀粉为原料。霉菌：大部分的霉菌可以直接使用淀粉为原料，他们本身具有淀粉的水解能力。第三节、淀粉水解糖的制备作为Glu发酵原料的水解糖液，必须具备以下条件：①糖液中还原糖的含量要达到发酵用糖的标准。②糖液洁净、杏黄色或黄绿色，有一定的透光度。③糖液中不含糊精。④糖液不能变质。原料：薯类（甘薯、木薯等）、玉米、小麦、大米（或碎米粉）例一、淀粉水解糖的制备方法酸解法以酸为催化剂，在高温高压下将淀粉转化为葡萄糖的方法。酸酶法先将淀粉用酸水解成糊精或低聚糖，再用糖化酶水解成葡萄糖。酶酸法将淀粉先用α—淀粉酶液化，然后用酸水解成葡萄糖。双酶法用淀粉酶和糖化酶将淀粉水解成葡萄糖的工艺。１、酸解法：以酸为催化剂，在高温高压下将淀粉转化为葡萄糖的方法。优点：生产方便，设备要求简单，水解时间短、设备生产能力大等。缺点：设备？淀粉转化率？淀粉原料？淀粉乳浓度？要求有耐腐蚀、耐高压、耐高温的设备。酸水解过程化学反应复杂，副反应多，淀粉转化率低。酸水解法对淀粉原料要求较严格，淀粉颗粒不宜过大，大小要均匀。淀粉乳浓度不宜过高，浓度高，淀粉转化率低。２、双酶法：用淀粉酶和糖化酶将淀粉水解成葡萄糖的工艺。优点：设备？淀粉转化率？淀粉乳浓度？糖液质量？缺点：酶解反应时间长(48h)，需要的设备多；而且酶本身也是蛋白质，易引起糖液过滤困难。反应条件温和，不需耐腐蚀、耐高压、耐高温的设备，便于就地取材，容易运作。酶作用专一性强，淀粉水解的副反应少，因而水解糖液的纯度高，淀粉转化率高。可在较高淀粉乳浓度下水解，而且可采用粗原料。该法制得的糖液较纯净，质量高，有利于糖液的充分利用。３、酸酶法：先将淀粉用酸水解成糊精或低聚糖，再用糖化剂水解成葡萄糖。对于淀粉颗粒坚硬的原料４、酶酸法将淀粉先用α—淀粉酶液化，然后用酸水解成葡萄糖。对于颗粒不均匀的原料。

表：酸法与双酶法糖液质量比较项目酸水解法双酶法项目酸水解法双酶法葡萄糖值(DE值)葡萄糖含量(干基)灰分蛋白质羟甲基糠醛色度淀粉转化率工艺条件9186％1.6%0.08%0.30%10.090%高温高压9897%0.1%0.1%0.003%0.298%高温过程能耗副产物生产周期设备规模防腐要求葡萄糖收得率适合发酵生产工艺情况多多短小高较低差少少长大低交酸法高10％有利总结优缺点？二、淀粉酸水解原理三、淀粉酸水解工艺１、淀粉酸水解的工艺流程⑴、淀粉乳浓度的选择淀粉乳的浓度越低，水解液的葡萄糖值越高，色泽越淡。２、淀粉酸水解条件控制及对糖液质量的影响淀粉乳浓度/ºBx2624222019181716DE值89.1789.2789.9291.1091.392.7792.8193.01Bx(玻利克斯)：

定义：某一溶液的Bx，表示该溶液的比重和相同浓度（为Bx%）的蔗糖溶液的比重相等。⑵、酸的种类和用量工业上普遍使用盐酸、硫酸和草酸。一般用盐酸量占干淀粉的0.6%～0.7%，pH值调至1.5左右。⑶、糖化的压力和时间压力与水解速率成正比。中和：降低糖液的酸度，调节pH值，使糖液中胶体物质析出，便于过滤除去。中和剂：纯碱、烧碱。脱色、除杂活性炭吸附法、离子交换法、新型磺化煤脱色压滤一般采用60～70°C温度压滤。３、水解糖液质量的中和脱色除杂四、双酶水解法制糖糊化液化糖化（一）液化1、淀粉酶的水解作用。2、淀粉液化的条件及液化程度的控制淀粉的糊化与老化液化的方法与选择老化：淀粉的老化实际上是分子间氢键已断裂的糊化淀粉重新排列形成新的氢键的过程，也就是复结晶过程。各类液化方法的比较液化方法基本条件优点缺点酸法液化淀粉乳含量30％，pH值1.8~2.0,液化温度135，10min，液化DE值15％～18％适合任何精制淀粉，所得的糖液过滤性能好有色物质及复合糖类生成，淀粉转化率低，糖液质量差，糖化液中含有微量醇和不溶性糊精酶法液化间歇液化法（升温液化法）淀粉乳含量30％，pH值6.5,0.01mol/L,液化温85~90,30~60min，液化DE值15％～18％设备要求低，操作容易。液化效果一般，经糖化后的糖化液过滤性能差，糖浓度低半连续液化法（高温液化法）淀粉乳含量30％，pH值16.5,液化温度90，30~60min，液化DE值15％～18％设备要求低，操作容易，效果比直接升温好料液容易溅出，操作安全性差，蒸汽用量大，液化温度未达到高温酶的最适温度，液化效果一般，糖化液过滤性能差喷射液化法淀粉乳含量30％，pH值6.5,液化温度95~14010~120min，液化DE值15％～17％液化效果好，液化液质量好，葡萄糖的收率高3、蒸汽喷射液化工艺工艺流程①在配料罐内，淀粉加水调制成淀粉乳，用Na2CO3调pH值处于5.0~7.0之间。②加入0.15%的氯化钙作为淀粉乳的保护剂和激活剂，再加入耐温α─淀粉酶，搅拌匀后用泵打入喷射液化器。③从喷射器中出来的料液和高温蒸汽直接接触，料液在很短时间内升温至95~97度。④此后料液进入保温罐保温60min，温度维持在95~97度，然后进行二次喷射。3、工艺及条件

蒸汽喷射液化工艺流程：调浆

配料

一次喷射液化

液化保温

95-97℃60min

二次喷射

高温维持

二次液化145℃3-5min95-97℃30min

冷却

糖化碳酸钠调pH、CaCl2、酶水蒸汽喷射液化工艺⑤在第二只喷射器内料液和蒸汽直接接触，使温度迅速升至145度以上，并在维持罐内维持该温度3～5min左右，彻底杀死耐高温α─淀粉酶。⑥料液经真空闪急冷却系统进入二次液化罐，将温度降低到95～97度。⑦在二次液化罐中加入耐高温α─淀粉酶，液化约30min，用碘呈色试验合格后，结束液化。特点：短时间内快速升温，完成糊化、液化，使形成的不溶性淀粉颗粒在高温下分散，数量也大为减少，从而使所得的液化液透明又易于过滤，淀粉的出糖率也高。采用真空闪急冷却，增高了液化液的浓度喷射液化法1、糖化酶的水解作用2、糖化的工艺条件及控制（二）、糖化1、糖