禤淑霞-环境基因组学：研究除草剂2,4-D毒性和抗性机制pp

摘要前沿用酵母模型来阐明基因-环境的相互作用用植物模型来阐明基因-环境的相互作用总结与展望第一页，共21页。摘要利用基因组学的信息和工具，能够更好的理解各种有机体与周围的环境的相互作用。在这里，我们揭示了环境基因组学这个新的领域如何研究2,4-D氯化苯氧乙酸除草剂(2,4-D氯化苯氧乙酸)的毒理作用机制和抗性的基本原理。2,4-D是最成功和最广泛使用的除草剂之一，但它的过度使用已经导致杂草抗药性的增加，而且当使用浓度高于推荐浓度的时候也引发了一些毒物学的问题。这篇综述以酿酒酵母和拟南芥两种模式生物来展开关于2,4-D的毒性和相应的反应。第二页，共21页。前言2,4-D的广泛和高强度的使用可能导致一些毒物学的和环境的问题，而且已经导致出现了抗药性增加的杂草（造成重大的经济损失，威胁环境和人类健康）利用酿酒酵母和拟南芥两种模式生物，并结合了基因-基因的方法，研究2，4-D毒性作用机制和适应反应。在一个细胞或组织的DNA（基因型），RNA（转录组学），蛋白质（蛋白质组学）和代谢物（代谢组学）水平上，研究所有基因的表达与毒物的响应，这种新的毒性系统论方法被认为是毒理基因组学。这种新的各学科间交叉的领域把新的技术和研究病理学和毒物学的较传统的工具结合起来，进而研究在环境压力下生物的反应。生物学系统方法论提供了一个空前有力的工具来直接监控毒物学的最早期的反应。通过微阵列或表达蛋白质组学，在几乎一出现毒物反应时就能检测出发生变化的全部基因的表达。而毒性的临床反应可能会几天甚至几年才表现出来。因此，比起传统的毒物学方法，评估这些基因表达的改变可能提供一个更早更灵敏的毒性反应的生物标记。第三页，共21页。用酵母和植物模型来阐明基因-环境的相互作用

真核模型系统的开发有助于人们了解对环境刺激对人类健康所产生的影响。由于很多信号途径和它们的分子组成成分充分保留在模式真核生物中，这些模型系统也成功解释化学分子在这些基本途径中的表达和功能。大量的模式系统改进了高质量高通量的基因组工具和增加了数据库。酿酒酵母是单细胞的真核模型，具有非致病性，便宜，容易进行遗传操作，好的特性以及快速生长率等特点。借助于简单可用的数据库和几年的后基因组研究也收集了大量的生物学信息拟南芥的小型，快速生活周期和多种子产量使得人们关注并研究了它的强烈的遗传性，生化和生理超过40年，从而为实验室操作和培养提供了有利条件。大量的基因组资源使得拟南芥可以对植物在非生命的压力时的反应进行系统选择的分子和系统广泛的研究第四页，共21页。酵母对2，4-D的全面反应，评估2，4-D的毒性

通过多药物抵抗和细胞外被膜重排来解毒

细胞内酸化和pH恢复

强氧化剂反应和抗氧化性反应

一般胁迫应激反应营养限制的感应和反应：TOR途径的作用

第五页，共21页。拟南芥对2,4-D应激反应除草剂2,4-D作用的模型分子机制研究通过多药耐药运输来解毒

细胞内pH恢复和膜或细胞壁改变普通压力应激TOR途径第六页，共21页。图3，酵母对2,4-D适应性反应的模式。(a)刺激反应的H+-ATPases出现在质膜和液泡膜中。(b)抗氧化防卫活化。(c)基因转录活化编码多药物运输，推定涉及除草剂抗衡离子的主动运输，细胞壁和质膜重排。(d)通过TOR途径进行选择性营养新陈代谢的活化作用

第七页，共21页。在低pH环境中，高亲脂弱酸性的2，4-D呈现未解离的亲脂毒性状态（RCOOH），因此经由被动扩散能容易地通过质膜。在中性的细胞溶质中，2，4-D的非解离形式分解，导致细胞内酸化和毒性抗衡离子的堆积（RCOO−），而不能轻易的通过质膜脂质双分子层。因此，低的pH值（例如酸性土壤，动物消化道）会显著的引起除草剂的毒性。第八页，共21页。在酵母中，多重抗药性质膜转运属于扩散载体超家族(MFS)或ATP结合盒(ABC)超家族，给予药物和其他化学应力组成的抗性，可能是促进了它们的非亲脂性状态的转变。在MDR家族中Tpo1p和Pdr5p（分别属于MFS和ABC超家族）的参与酵母对2，4-D的抗性的基础上，假设这些质膜运输促进了2,4-D抗衡离子的主动运输。对2,4-D起抗性的酵母9个基因[编码MDR运输和由相同的多重药物抗性（PDR）调整网络控制]进行了微阵列分析，发现只有TPO1和PDR5能确定在对除草剂的抗性中起到决定性作用。在2,4-D刺激下一些基因（包括细胞壁重塑）上调。这些包括SPI1编码减少壁孔和亲脂性2,4-D通过质膜的细胞壁蛋白的表达。在质膜组成水平上的改变，包括增加了膜脂肪酸的饱和度。这些适应性机制保护膜脂氧化，对于生物膜的流动性和功能有深刻的影响。由OLE1编码的Δ9脂肪酸去饱和酶减少转录（催化饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸的转化），以适应2,4-D第九页，共21页。细胞内的酸化可能抑制大量生物反应，特别是H+依赖的跨膜运输。分析对2,4-D适应时的酵母蛋白质组的改变，显示了液泡H+-ATPase(V-ATPase)的两种亚基Vma1p和Vma2p的含量增加。V-ATPase活性的刺激和质膜H+-ATPase的活化，可能使酵母细胞部分中和细胞内酸性，并最终在中性除草剂胁迫下继续生长第十页，共21页。在2,4-D胁迫下，羟基和脂质过氧化水平增加部分基因上调，这些基因涉及参与β-氧化过氧化物酶和线粒体氧化磷酸化反应，这两个主要的代谢反应导致了内部生成活性氧化物(ROS)。2,4-D也会导致线粒体呼吸链的电子渗漏，以及催化和诱导老鼠细胞的脂肪酸的β-氧化。可能会更快的增加ROS的生成量2,4-D诱导一种烷基过氧化物酶AhplP氧化形式数量的增加。微阵列分析结果指出那些涉及谷胱甘肽和硫氧还蛋白代谢和重要的NADP余因子再生的基因也上调以应对除草剂。这些抗氧化防卫的刺激与羟基水平的逐渐减少相一致，酵母细胞群体适应除草剂并能重新回到对数生长期。第十一页，共21页。图4利用定量蛋白质组学来研究酵母对2,4-D的反应。用2D电泳分离酵母蛋白质组。在暴露在除草剂后，相对蛋白丰度和修正的一些改变已经强调出来，特别是涉及一般胁迫应激的蛋白(Hsp12p),氨基酸耗损(His4pandMet6p)和氧胁迫反应（减少和Ahp1p的氧化形式）。第十二页，共21页。非特异性转录重编，发生在应激性胁迫下，并由转录因子Msn2p和Msn4p控制，并认为是适应2,4-D的反应之一目的基因编码热休克蛋白，分子伴侣和抗氧化物酶，这些可能涉及在酵母暴露在2,4-D后出现的体内变性环境后保护或变性蛋白的恢复。在Sfp1p和Rap1p的控制下减少蛋白合成，在Rpn4p的控制下增加蛋白质变性，这也是普通应激反应的特征。这个反应，也假设是2,4-D诱导的转录广泛性改变，也推测是在压力下维持蛋白翻译的准确性。Rpn4p一个可能与遍在蛋白化-蛋白质组途径相关的多药抗性适配器，也显示出对2,4-D活性基因大约有>8%的调整。在2,4-D侵略后，涉及RNA和蛋白变性的蛋白的浓度的增加也呈现出定量的蛋白质组学。第十三页，共21页。经微阵列和蛋白质组学分子分析，酵母对2,4-D的全面反应表明大量的基因上调，这些基因涉及碳源和氮源代谢中氨基酸生物合成的改变，并引起体内氨基酸浓度的剧烈减少。2,4-D作用于质膜脂质组成和渗透性而禁止营养的输入。除草剂增加了双分子层的宽度和膜系统疏水结构域的深度结构摄动。另外，在兔大脑和老鼠肌肉组织中一些膜联合溶质运输系统受到限制。整合很多来自转录组学的数据，表明2,4-D的出现使TOR途径受到抑制。这个信号途径控制蛋白合成和降解的平衡，以响应营养数量和质量，从而保证营养代谢的转录控制。第十四页，共21页。植物激素可以诱导氨基环丙烷羧酸合成酶的从头合成，ACC水平的放大，乙烯的直接前体，导致涉及应激反应，植物生长和衰老的气态植物生长素浓度的大量增加。可能通过叶黄素类的分裂，增加的乙烯浓度轮流引发脱落酸(ABA)的生物合成，脱落酸的积累会导致生长抑制，形态变异和衰老。与这个模型一致，最近基因组广泛的基因表达对在拟南芥中2,4-D除草浓度的效应的研究报道了一些涉及的生长素反应，乙烯信号，和脱落酸合成，发出信号和反应的基因的调整。另外，除草剂对一些涉及细胞生长和延长的基因表达有下调作用，而对非生物和生物刺激都有反应的基因却有上调作用。第十五页，共21页。图5拟南芥中2,4-D的除草浓度产生的可见的表型效应，包括叶片衰老，干燥，和抑制跟的延长和分支。最初的图来自(a)3周大的植物在1

mM2,4-D中2h，(b)5天大的植物在0.1

μM2,4-D中6天第十六页，共21页。拟南芥有一些与ScTPO1有高度同源性的MFS开放阅读框，和之前在植物中描述的Pdr5-like蛋白。有趣的是，2,4-D对植物的第一个PDR基因起到诱导作用生物信息学分析指出拟南芥基因组有15个编码运输蛋白的基因，而其中只有三个(AtPDR8,AtPDR9andAtPDR12)在功能水平上进行了鉴定。与涉及2,4-D输出的同系性ScPdr5p酵母运输一致，AtPDR9也决定了植物对除草剂的抗性。AtPDR9催化根部细胞的2,4-D输出而不影响内部生长激素的运输。为了揭露额外的MDR运输在植物细胞输出2,4-D时起到的作用，需要做进一步的研究，从而为利用生物技术解决杂草除草剂抗性做好准备。第十七页，共21页。植物激素诱导质膜H+-ATPase的活性，H+-ATPase在植物根部可维持细胞内pH值，从而调节除草剂抗性有2,4-D存在时，分离的植物膜中磷脂酰肌醇的降解会增强，mRNA堆积物及低聚糖和木聚糖在细胞壁的溶解相关联。关于2,4-D对质膜和细胞壁结构的特殊作用的进一步研究对阐明在杂草除草剂抗性的研究有重要的意义第十八页，共21页。对暴露在2,4-D后受到诱导的拟南芥转录学组的改变进行整体分析，结果显示涉及植物胁迫整体应激的一系列基因都受到调节。两种植物激素--乙烯和ABA，在拟南芥的胁迫应激反应中起到重要的作用。微阵列分析中一些涉及生物合成或是信号传递和一些压力反应激素的基因(e.g.NCED,ABF3,COR78,KIN1)确实得到上调。然而，其他压力相关的基因并没有直接受到植物激素的调节（如防御和保卫基因，解毒作用的基因）第十九页，共21页。在酿酒酵母中第一次描述的TOR蛋白和途径，与真菌和哺乳动物中的有密切同源性和相似功能虽没有在植物中进行研究但TOR蛋白(AtTOR)存在于植物中，已有报道指出在拟南芥中有TOR激酶途径：分生组织顶芽生殖部位和胁迫信号的生长调节表明这个途径在较高级的真核细胞中有一个相似的作用，和对杂草抗性有影响。第二十页，共21页。总结和展望整体基因组的表达技术在鉴定那些受重要的化学物在早期毒物学反应影响的基因有广泛的应用潜力。这技术对毒物的毒物学机制的阐明可能有用，而且有助于关联风险的描述。酵母提供了一个有用的实验模式来研究处于重要的农用化学除草剂2,4-D的毒理学作用的基础分子机制和相关的适应响应。拟南芥的补充应用为研究2,4-D特殊作用在目的杂草中和它们的除草剂抗性机制的提供了有力证据。当2,4-D作为强氧化剂或