发酵工业菌种改良

发酵工业菌种改良第1页，共54页，2023年，2月20日，星期三方法基因突变：自然选育、诱变育种基因重组：杂交、原生质体融合、基因工程基因的直接进化：点突变、易错PCR、DNAShuffling等第2页，共54页，2023年，2月20日，星期三一、基因突变突变：指生物体的表型发生的可遗传的变化。狭义突变：基因突变—点突变广义突变：基因突变和染色体畸变突变的几率：10-6---10-9

野生菌株---突变-----突变株第3页，共54页，2023年，2月20日，星期三选择性突变

非选择型突变（一）基因突变类型（表型分类）形态突变型（株）抗原突变型（株）产量突变型（株）营养缺陷型（株）抗性突变型（株）条件致死突变（株）第4页，共54页，2023年，2月20日，星期三营养缺陷型——因突变而丧失合成某种物质的能力，因此必须在培养基中添加某种物质才能生长的突变类型。抗性突变型——因突变而产生了对某种化学药物或致死物理因子的抗性的突变株。第5页，共54页，2023年，2月20日，星期三条件致死突变型——突变后在某种条件下可正常生长繁殖，而在另一条件下却无法生长繁殖的突变型抗原突变型——因突变而引起的抗原结构发生改变第6页，共54页，2023年，2月20日，星期三（二）突变率每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率。突变率为10–8是指该细胞在一亿次细胞分裂中，会发生一次突变。突变率也可以用每一单位群体在每一世代中产生突变株突变率=突变细胞数/分裂前群体细胞数第7页，共54页，2023年，2月20日，星期三突变是独立的。某一基因发生突变不会影响其它基因的突变率。第8页，共54页，2023年，2月20日，星期三（三）基因突变的特点以细菌的抗药性为例。不对应性：突变的性状与突变原因之间无直接的对应关系。自发性：突变可以在没有人为诱变因素处理下自发地产生。稀有性：突变率低且稳定。第9页，共54页，2023年，2月20日，星期三独立性：各种突变独立发生，不会互相影响。可诱发性：诱变剂可提高突变率。稳定性：变异性状稳定可遗传。可逆性：正向突变率=回复突变率第10页，共54页，2023年，2月20日，星期三（四）基因突变的机制自发突变诱发突变第11页，共54页，2023年，2月20日，星期三第12页，共54页，2023年，2月20日，星期三二、突变与育种（一）自发突变与育种1、生产中育种

10-6突变率---寻找正向突变菌株2、定向培育优良菌种牛型结核杆菌------13年----230代----卡介苗（减毒活菌疫苗）第13页，共54页，2023年，2月20日，星期三（二）诱变育种诱变+筛选诱变是随机的；筛选是定向的目前发酵工业生产菌株都是经过突变改造过的。第14页，共54页，2023年，2月20日，星期三1、诱变育种的基本规律第15页，共54页，2023年，2月20日，星期三2、诱变育种中的几个原则诱变剂的选择诱变基本过程诱变剂剂量的选择诱变剂的处理方法突变株的筛选第16页，共54页，2023年，2月20日，星期三（1）诱变剂的选择诱变剂作用的普遍性：在其它菌种选育中诱变效果好的诱变剂。如：UV亚硝基胍（NTG），快中子诱变剂的特异性：经验之谈

四环素族抗生素用亚硝酸、羟胺，青霉素用氮芥、乙烯亚胺、亚硝基胍．第17页，共54页，2023年，2月20日，星期三菌株的差异：（即使是同一菌）

A：遗传性不稳定的菌株------用缓和诱变剂

B：遗传性稳定的菌株-----首用强，后用缓。考虑诱变机制：

UV嘧啶，亚硝酸嘌呤，因此复合用为好第18页，共54页，2023年，2月20日，星期三（2）诱变基本过程第19页，共54页，2023年，2月20日，星期三选择合适的出发菌株↓制备待处理的菌悬液↓诱变处理↓筛选↓保藏和扩大试验第20页，共54页，2023年，2月20日，星期三出发菌株的选择出发菌株应具备①对诱变剂的敏感性高；②具有特定性状的生产能力第21页，共54页，2023年，2月20日，星期三◆出发菌株的来源①自然界分离到的野生型菌株：②历经生产考验的菌株：③已经历多次育种处理的菌株：第22页，共54页，2023年，2月20日，星期三制备单细胞或单孢子悬液要求

①菌体处于对数生长期，

②细胞分散且为单细胞，

方法：①玻璃珠打散10-15min;

②加０.3%吐温80

③用无菌脱脂棉过滤。

制备：物理诱变剂——生理盐水

化学诱变剂——缓冲液

浓度：细菌、放线菌108个/ml

霉菌、酵母菌106个/ml第23页，共54页，2023年，2月20日，星期三（3）诱变剂剂量的选择用50—85%的杀菌剂量，此时正突变率高，特别是出发菌株已是高产菌株第24页，共54页，2023年，2月20日，星期三诱变剂的剂量对产量变异影响的可能结果

a.未经诱变剂处理；b.变异幅度扩大，但正负突变相等；c.正突变占优势；d.负突变占优势第25页，共54页，2023年，2月20日，星期三（4）诱变剂的处理方法诱变剂使用方式

单一处理

复合处理

诱变处理条件：温度（生长温度）

PH（缓冲剂）处理时间诱变作用的终止：用解毒剂、用水稀释第26页，共54页，2023年，2月20日，星期三第27页，共54页，2023年，2月20日，星期三（5）突变株的筛选筛选条件：基因型+环境=表型表型迟延充分表达分离性迟延现象生理性迟延现象第28页，共54页，2023年，2月20日，星期三（5）突变株的筛选合适的筛选方法：

平皿快速检测法变色圈法透明圈法生长圈法抑菌圈法梯度平板法摇瓶培养法第29页，共54页，2023年，2月20日，星期三第30页，共54页，2023年，2月20日，星期三第一轮：一个出发菌株→→→选出200个菌株→→→选出50株→→→选出5株诱变处理初筛

（每瓶一株）复筛（每瓶四株）第二轮：5个出发菌株→→→→→→选出50株→→→选出5株40株40株40株40株40株诱变处理初筛复筛（每瓶一株）（每瓶四株）第31页，共54页，2023年，2月20日，星期三3、三类突变株的筛选产量突变株筛选抗药性突变株的筛选营养缺陷型的筛选第32页，共54页，2023年，2月20日，星期三

（1）产量突变株筛选琼脂块培养法（春日霉素）孢子悬液------诱变----适当培养（表型迟）-涂布平板----打孔取菌落-----琼脂块培养4-5天—测定琼脂块所含的抗生素的抑菌圈----效价高菌第33页，共54页，2023年，2月20日，星期三第34页，共54页，2023年，2月20日，星期三（2）抗药性突变株的筛选（梯度平板法）第35页，共54页，2023年，2月20日，星期三第36页，共54页，2023年，2月20日，星期三抗药性突变株的应用：*作为菌株的遗传标记*作为生产菌种

（结构类似物抗性突变株）如“吡哆醇高产菌株的筛选”第37页，共54页，2023年，2月20日，星期三第38页，共54页，2023年，2月20日，星期三（3）营养缺陷型(auxotroph)的筛选A：有关的三类遗传型个体：营养缺陷型突变株：野生型菌株：原养型菌株：第39页，共54页，2023年，2月20日，星期三B有关的三类培养基基本培养基（MM）[-]：凡是能满足野生型菌株营养要求的最低成分的合成培养基。完全培养基（CM）[+]：满足一切营养缺陷型菌株生长的天然或半合成培养基。

补充培养基（SM）[x]：在MM中有针对性地加入一或几种营养成分以满足相应营养缺陷型菌株生长的合成培养基。第40页，共54页，2023年，2月20日，星期三C营养缺陷型的筛选步骤C-1：诱变处理（同前讲述）C-2：淘汰野生型（浓缩缺陷型）C-3：检出缺陷型

C-4：鉴定缺陷型第41页，共54页，2023年，2月20日，星期三C-2：淘汰野生型（浓缩缺陷型）（1）抗生素法野生型菌株在MM上生长

+青霉素—杀死Ｇ＋缺陷型菌株在MM上不生长＋青霉素—-不杀死制霉菌素法则适合于真菌第42页，共54页，2023年，2月20日，星期三抗生素处理完后，离心收集细胞，并转入低渗溶液第43页，共54页，2023年，2月20日，星期三（2）菌丝过滤法适于：丝状（放线菌、霉菌）原理：野生型基本培养基上发育成菌丝；缺陷型孢子不萌发可通过滤膜，野生型菌丝不能通过。第44页，共54页，2023年，2月20日，星期三第45页，共54页，2023年，2月20日，星期三C-3:检出缺陷型逐个检出法影印检出法夹层培养法限量补给法第46页，共54页，2023年，2月20日，星期三逐个检出法

第47页，共54页，2023年，2月20日，星期三影印检出法第48页，共54页，2023年，2月20日，星期三夹层培养法第49页，共54页，2023年，2月20日，星期三限量补给法在含少量的（0.01%）蛋白胨的MM上培养,大菌落为野生型小菌落的为缺陷型。第50页，共54页，2023年，2月20日，星期三C-4:鉴定缺陷型生长谱法组合营养物法组合补充培养基法第51页，共54页，2023年，2月20日，星期三生长谱法斜面菌种-----生理盐水洗下细胞------洗涤-----涂布（105个/皿）第52页，共54页，2023年，2月20日，星期三纸片1:氨基酸混合液;纸片2:维生素混合液;纸片3:核酸水解液;纸片4:酵母水解液第53页，