干细胞移植在糖尿病治疗上应用

干细胞移植在糖尿病治疗上应用第1页/共69页第2页/共69页第3页/共69页《Science》于1999年和2000年连续两次将干细胞技术评为世界十大科学成就之一。干细胞技术是医学发展的未来第4页/共69页干细胞技术是医学发展的未来第5页/共69页干细胞治疗的原理及应用干细胞的分类干细胞治疗原理干细胞治疗常用细胞种类干细胞治疗的适应症干细胞治疗的常用治疗方案第6页/共69页内群细胞受精卵成人胚胎囊胚全能细胞

原生殖细胞多能干细胞人体是由200多种不同组织约1000万亿个细胞组成的有机体,所有的细胞均起源于一个干细胞——受精卵。

干细胞技术最显著的作用：

能再造一种全新的、正常的甚至更年轻的细胞、组织或器官。“人体干细胞”是指来源于人体的一群具有自我复制能力和多向分化潜能的细胞。什么是干细胞?第7页/共69页干细胞的分类胚胎干细胞（ESC）经诱导的多能干细胞（iPS）成体干细胞(ASC)造血干细胞（HSC）内皮祖细胞(EPC)间充质干细胞（MSC）神经干细胞肝脏干细胞脂肪干细胞肌肉干细胞………8第8页/共69页干细胞技术原理干细胞复制前体细胞各种组织细胞体外人工培养干细胞，利用干细胞构建细胞、组织、器官来修复组织器官将是未来生物医学工程研究应用的主要方向。

第9页/共69页第10页/共69页第11页/共69页第12页/共69页目前细胞治疗常用的细胞来源

骨髓：自体，异体

外周血：自体脐血：自体，异体脐带：异体

脂肪：自体

其它：胎脑、胎胰腺等等13第13页/共69页目前细胞治疗常用的细胞种类一：骨髓总有核细胞（NC）从自体骨髓获得，去除大部分红细胞，剩下的全部具核细胞。

其中富含各系血细胞、造血干细胞、造血各系祖细胞、血管内皮祖细胞和内皮细胞。14第14页/共69页目前细胞治疗常用的细胞种类二：单个核细胞（MNC）从自体骨髓或异体脐血中获得，去除绝大部分红细胞、血小板、巨核细胞和多核细胞，剩下的单个核细胞。

其中富含胚胎样多能干细胞、造血干细胞、造血各系祖细胞和血管内皮祖细胞。15第15页/共69页目前细胞治疗常用的细胞种类三：CD34+细胞（HSC&EPC）从骨髓或脐血单个核细胞中经免疫磁珠法分选的表达CD34糖蛋白的细胞。

其中造血干细胞和血管内皮祖细胞的纯度极高，对实验室人员操作要求较高。16第16页/共69页目前细胞治疗常用的细胞种类四：间充质干细胞（MSC）

首先分离骨髓、脐带或脂肪组织的单个核细胞，经过培养获得贴壁细胞群，呈梭形，体型较大，能分化为多种细胞。

其中富含间质干细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、树突状细胞和内皮细胞。还残留少量单个核细胞。对实验室操作人员要求较高。17第17页/共69页第18页/共69页目前细胞治疗的适应症脑外伤、脊髓外伤性瘫痪后遗症、脑发育不全、癫痫、脑瘫等；帕金森病、老年痴呆症、肌营养不良症、多系统萎缩症、肌萎缩侧索硬化症、脊髓性肌萎缩、脑梗塞等；19第19页/共69页目前细胞治疗的适应症股骨头坏死多发性硬化、系统性硬皮病、红斑狼疮、关节炎（风湿和类风湿）心肌梗塞肝硬化、慢性胃炎糖尿病20第20页/共69页目前细胞治疗的适应症肾内科：肾病、尿毒症妇科：卵巢早衰眼科：视神经炎、视神经发育不良和萎缩、视网膜色素变性新生儿科：缺氧性脑病、新生儿发育不良、脑瘫；21第21页/共69页必须经过多种检测确保细胞质量和安全1.细胞染色形态观察（瑞氏染色…）2.活细胞计数（台盼蓝法…）3.生长曲线的测定（MTT法…）4.克隆形成率（colonyformingassay）5.细胞表型（CD34、CD45、CD90、CD105、CD44、CD146、Stro-1、CD200、CD271、SH-2、

SH-3、

SH-4等）分析（流式细胞仪法、免疫组织化学法）6.内毒素检测7.细胞凋亡检测8.细胞周期分析9.核型分析10.端粒酶活性检测11.相关常见检测基因（BETA-LAC）12.裸鼠致瘤性实验13.软琼脂侵袭实验14.体外分化检测实验：骨细胞方向、神经细胞方向、脂肪细胞方向.第22页/共69页细胞治疗的原理细胞治疗的作用机制可能是多方面的：①

MSC可产生细胞因子，或通过减少细胞凋亡起到保护作用，对组织功能恢复发挥积极作用；例如MSC分泌的特异性神经递质及神经营养因子，如神经生长因子、脑源性神经生长因子等神经营养因子，可使轴索实现跨胶质瘢痕屏障的生长，促进脊髓损伤的修复；23第23页/共69页细胞治疗的原理这些旁分泌信号分子可通过刺激血管形成、防止移植基质降解和局部细胞凋亡,并可促使内源性修复细胞迁移和归巢至受损部位，协同改善组织重塑过程。24第24页/共69页细胞治疗的原理②此外受损的细胞的恢复生长还需要周围的一些正常细胞成为生长信号的生产工厂供其使用，即其必须招募一些保姆细胞，移植入的成纤维细胞和内皮细胞即可完成这个任务，帮助内源性残存组织细胞生长分化。第25页/共69页细胞治疗的原理③

MSC具有免疫调节能力，MSC可以降低过度免疫对机体的损坏：抑制DC的抗原递呈能力；抑制NK细胞毒活性；减轻中性粒细胞的呼吸爆发；抑制抗原特异性T细胞增殖、CTL细胞毒性和促进调控性T细胞生成的方式调控免疫反应的强度；能够将B细胞停滞在细胞周期的G0/G1期，抑制由抗免疫球蛋白抗体，IL-2,IL-4等不同刺激引起的B细胞增殖，然而MSC并不会诱导B细胞凋亡，反而会更好的维持B细胞的存活。26第26页/共69页第27页/共69页细胞治疗的原理④MSC可向内皮细胞分化；EPC可向心肌梗死区归巢,参与构建毛细血管网并分泌血管形成因子,并且本身可以分化为血管内皮细胞和平滑肌细胞；具有多分化潜能的MSCs可增殖并增补EPC，MSC中的EPC可直接参与受损局部血管的形成及损伤修复过程；28第28页/共69页细胞治疗的原理⑤干细胞移植后向病变部位组织渗透融合，一些移植的干细胞在新的环境下分化成功能细胞，替代损伤细胞，达到恢复组织细胞功能的目的。29第29页/共69页目前细胞治疗常用的回输方式一：静脉回输（简单，损伤小）二：局部注射肌肉（对改善微循环/肌张力有明确疗效）椎管脑室三：经脉管介入（疗效有待于进一步研究）30第30页/共69页细胞治疗的回输时间炎性因子在梗死坏死组织的表达会显著上调,参与组织的修复、促进梗死部位的新血管生成与干细胞的归巢和转分化。强烈的炎症微环境影响MSCs的生存；结果表明,组织梗死后1周可能是较有利于MSCs归巢和存活的合适的植入时间。31第31页/共69页目前细胞治疗常用的回输方式干细胞治疗疾病根据方式方法的不同每个疗程治疗1-4次，每次治疗间隔5-10天，原则上每个疗程间隔的时间是3－6个月，如疗效明显，可视病情连续做2－3个疗程。（每次疗程治疗可应用不同干细胞组合）32第32页/共69页干细胞注射之后的示踪研究许多研究表明移植MSCs疗法的疗效有限,主要的原因之一是它难以确保足够数量的细胞归巢至病变组织；MSC回输体内的第一步就是向血管内皮粘附;MSC具有跨内皮细胞游出并进入组织的能力实验室动物研究表明，回输后48小时内，肺毛细血管网、肾毛细血管网是MSC粘附最多的部位，肝、脾也有少量细胞发现。

第33页/共69页可能的副作用其主要副作用为自限性低热。其它所观察到的副作用均为1或2级并且具有自限性(包括头痛、头晕、恶心、皮疹、搔痒、心动过速)，未有患者出现肺或肾部的症状、任何迹象的感染、肝功能衰退或自身免疫失调反应。潜在的生成肿瘤的风险性椎管和脑室注射应考虑到脑压变化可能引起的副作用。第34页/共69页干细胞与糖尿病第35页/共69页2型糖尿病自然病程与血管病变结局尚在代谢正常状态基因？环境？代谢综合征胰岛素抵抗进展结局启动心脑血管疾病肾病视网膜病变血糖胰岛素抵抗β细胞功能第36页/共69页中国膳食文化渊源流长“五谷为养，五果为助，五禽为益，五菜为充”

——《黄帝内经·素问篇》民以食为天仓禀实而知礼节吃出来的血缘一饭定终身第37页/共69页动脉硬化概念

任何原因引起的动脉管壁增厚变硬、失去弹性和管腔缩小。内皮细胞内皮下层内弹力板内膜(止血、血栓形成、血管张力、通透性，动脉粥样硬化形成部位）中膜（平滑肌构成,血管张力）外膜（动脉供血和神经分布）动脉结构上皮细胞第38页/共69页病理性动脉硬化

动脉中层钙化：Monckeberg氏动脉硬化

病理所示在动脉中膜可见紫蓝色的钙化灶，而管腔没有受累。X线可以发现中膜钙化结节，但中膜的病灶并不影响血管腔。看不到明显临床表现，临床意义不大。

小动脉硬化

病理所示中层增厚,血管变硬,管腔狭窄。小动脉弥漫性增生病变，其发生与高血压和糖尿病有关。全身细小动脉硬化使许多脏器缺血，并发生结构和功能损害，其中对心、肾、脑的影响最为显著。

动脉粥样硬化：最常见、最重要的一种。主要病理学标志是泡沫细胞的形成，损伤从内膜开始，血管壁中有富含脂质的斑块形成，外观呈黄色粥样，可造成血管的狭窄，血管中层和外膜也可受累。第39页/共69页动脉粥样硬化引起的全身疾病表现颈动脉粥样硬化主动脉粥样硬化内脏动脉粥样硬化脑动脉粥样硬化冠状动脉粥样硬化下肢动脉粥样硬化急性脑血管病心绞痛心肌梗死缺血性心肌病主动脉瘤血管性痴呆夹层动脉瘤顽固性高血压肠系膜动脉血栓间歇性跛行坏疽急性脑血管病主要累及大型弹力型动脉（如主动脉）和中型弹力型动脉（冠状动脉和脑动脉最多）冠状动脉粥样硬化是动脉粥样硬化的最常见类型，是造成我国成年人死亡的头号杀手！顾东风,JiangHe,吴锡桂,等.中国成人主要死亡原因及其危险因素.中国慢性病预防与控制2006;14(3):149-154.第40页/共69页内皮功能受损炎症反应增加平滑肌细胞增殖和迁移形成纤维帽LDL进入内皮下被氧化巨噬细胞吞噬ox－LDL形成泡沫细胞

斑块破裂局部血小板聚集血栓形成动脉粥样硬化的形成损伤－反应学说认为LDL是致动脉粥样硬化的基本因素内皮损伤是关键因素炎症反应贯穿始终第41页/共69页血管摄影彩超核磁血管造影血管造影—诊断下肢PAD的金标准计算机断层扫描血管成像（CTA）磁共振血管显像。第42页/共69页正常血管第43页/共69页糖尿病患者的下肢血管造影第44页/共69页血管病变右侧腓动脉全段闭塞第45页/共69页血管病变左侧腘动脉全段闭塞第46页/共69页血管病变右侧髂动脉自起始部闭塞左髂动脉管壁虫蚀状第47页/共69页181例老年糖尿病患者接受ABI检测我国糖尿病患者1/4发生下肢血管病变

老年人群高达1/3强4675例2型糖尿病患者的足背动脉、胫后动脉进行触诊检查，以搏动明显减弱或消失为异常王爱红，许樟荣，等.老年医学与保健2005；11：147－149

王爱红，许樟荣，等.第四军医大学学报2005；26：1137－113924.5%35.36%发生下肢血管病变发生下肢血管病变第48页/共69页下肢血管病变是

死亡及严重血管事件的风险因子CurtDiehm,etal.Circulation.2009;120:2053-20616880名老年人（>65）随访5年显示：PAD对死亡及严重血管事件的风险比是2.17，高于严重心脑血管病史、性别、糖尿病、吸烟等其他风险因素第49页/共69页下肢血管病变越严重

无事件生存率越低CurtDiehm,etal.Circulation.2009;120:2053-2061结果显示ABI越低则无事件生存率越低第50页/共69页下肢血管病变引起糖尿病变患者肢体远端与足部缺血，最终可导致缺血坏疽糖尿病足是糖尿病下肢血管病变的

终末阶段PeripheralArterialDiseaseinPeopleWithDiabetes.2003Dec;26(12):3333-41.第51页/共69页湿性坏疽糖尿病足临床表现干性坏疽混合坏疽第52页/共69页溃疡和感染第53页/共69页坏死和截肢第54页/共69页糖尿病下肢PAD的特点病变广泛多部位、多节段病变更远端，小血管病变并有微血管病变手术难度大，效果相对差第55页/共69页危险因素修正

停止吸烟LDL-C<100mg/dL

糖化血红蛋白<7.0%

血压<130/85mmHg

血管紧张素转换酶抑制剂

抗血小板治疗

阿司匹林或氯比格雷外周动脉疾病评估跛行的严重性平板实验MWD和PFWD

SF-36和WIQ问卷严重的腿部缺血评估心血管危险因素跛行的治疗

监督下运动疗法

前列腺素类似物等症状改善症状恶化继续病变的诊断

血流动态的诊断

多普勒超声

磁共振血管造影

传统的血管造影血管的再成形

血管成形术

血管搭桥术Hiatt,W.R.:NEnglJMed,344(21),1608,2001外周动脉疾病患者的评估和治疗流程MWD：最大行走距离PFWD：无痛行走距离SF-36：MedicalOutcomesShortForm36questionnaireWIQ

：WalkingImpairmentQuestionnaire第56页/共69页下肢PAD评估年龄50-69岁并吸烟或糖尿病患者年龄大于70岁劳累后腿痛

下肢血管检查异常冠状动脉、颈动脉或肾动脉疾病ABI检测0.91

~1.30

0.90>

1.30脉波容积测定趾端压力测定多普勒超声图像检查踏车试验后检测ABI结果正常:无PAD结果异常运动后ABI正常:无PAD运动后ABI降低查找腿部症状的其他原因PADHiatt

WR.NEnglJMed,2001;344(21):1608-21第57页/共69页糖尿病下肢血管病变的治疗方案控制危险因素（基础治疗）降糖调脂降压抗血小板治疗戒烟下肢缺血的治疗（特殊治疗）步行锻炼药物介入或手术治疗抗凝干细胞第58页/共69页干细胞与糖尿病

糖尿病是一类严重的代谢疾病，正危害着世界上越来越多人口的健康。胰岛移植是一种治疗糖尿病的有效方法，却因供体缺乏和移植后免疫排斥问题制约了其广泛应用。干细胞为具有强增殖能力和多向分化潜能的细胞，是利用细胞替代疗法治疗重大疾病的细胞来源之一，其中成体干细胞因不存在致瘤性及伦理道德问题而被人们寄予厚望。成体胰腺干细胞在活体损伤及离体培养条件下均能产生胰岛素分泌细胞，肝干细胞、骨髓干细胞和肠干细胞等在特定离体培养条件下或经过遗传改造后也均可产生胰岛素分泌细胞，将这些干细胞来源的胰岛素分泌细胞移植到模型糖尿病小鼠中可以治疗糖尿病。因而，成体干细胞可以为细胞替代疗法治疗糖尿病提供丰富的胰岛供体来源。第59页/共69页干细胞治疗糖尿病机制干细胞对胰岛β细胞的修复干细胞对其他胰岛素分泌细胞的修复

干细胞对胰岛素抵抗的作用第60页/共69页目前应用的干细胞能够用分化为胰岛β细胞的成体干细胞：胰腺干细胞肝干细胞骨髓干细胞肠干细胞等第61页/共69页国内外研究现状研究者时间细胞类型回输方式结果航天中心医院血液内分泌科王意忠2009年1月自体外周血干细胞经动脉移植患者目前情况良好，血糖基本稳定，治疗取得了初步成功。第三军医大学重庆新桥医院2006年自体骨髓干细胞移植从患者自体骨髓中采集到的干细胞植入胰腺中经过一周术后观察，其胰岛素用量比手术前明显减少，血糖一直控制在正常值以内，比手术前有明显改善青岛大学附属医院2006年自体骨髓干细胞经胰腺血管插管移植1.100例,多数患者2周起效，且有低血糖表现。2.OAD及胰岛素用量减少。3.胰岛功能改善及血糖改善好转率63%左右第62页/共69页国内外研究现状青岛大学医学院附属医院内分泌科经骨髓穿刺技术抽取糖尿病患者自身的骨髓,分离出多能干细胞经皮血管介入的方式将干细胞移植到胰腺内1.

60例患者有49例疗效显著2.有效者表现为减少或停用胰岛素及口服降糖药后,血糖仍维持在正常或接近正常水平。中国南京军区福州总医院，美国迈阿密大学糖尿病研究所，欧洲意大利米兰大学，南美阿根廷国家干细胞中心，哥伦比亚5家国际合作单位2008年3月-2010年3月自体骨髓间充质+骨髓干细胞+高压氧治疗胰动脉介入该国际多中心协作组进行了25例预实验，达到初步预期效果。停用胰岛素或口服降糖药物后血糖维持正常，糖化血红蛋白由术前平均8.8±1.9%，降至术后平均6.5±1.2%。所有使用胰岛素的患者均出现了胰岛素用量下降，术前57.8±24.5单位/天，术后最终21.6±15.4单位/天。通过各种资料的统计分析，证实这项干细胞治疗2型糖尿病的技术在不依靠口服降糖药或胰岛素的前提下，大大提高了患者的胰岛功能，明显改善了血糖控制，逆转了2型糖尿病的病情，给患者带来前所未有的获益。临床安全性高，已经进行治疗的2型糖尿病未出现任何明显的治疗