总RNA提取、浓度的测定

总RNA提取.浓度的测定一.原理讨论基因的表达和调控时经常要从组织和细胞中分别和纯化RNA。RNA质量的凹凸经常影响cDNA库、RT-PCR^nNorthernBlot等分子生物学试验的成败。Trizol溶液是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNAO其含有苯酚、异硫氧酸服等物质，能快速破裂细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。Trizol在破裂和溶解细胞时能保持RNA的完整性，因此对纯化DNA及标准化RNA的生产非常有用。二、试验试剂及仪器氯仿（三氯甲烷1异丙醇、无水乙醇、冷PBS、DEPC水、灭酶枪头、一次性手套、EP管架、吸管、冷冻离心机4。（：预冷，眼科银，眼科剪（组织用）三.试验步骤组织:L将器械，组织管，匀浆器钻头提前用DEPC水浸泡过夜。灭酶EP管编号。2、将新奇组织剪切成黄豆大小的块，或冻存于液氮的样品（在离体后应快速冷冻在液氮中,也可加入保存）置入组织管内，加入500pLTrizol,用匀浆器充分研碎组织。使用后的匀浆器钻头分别置于2管75%乙醇（DEPC水配制），2管DEPC水中空转后方可进入下一组织浆中。3、吸出研碎的粉红色匀浆至EP管内，室温静置10-15min。4、加入200pL氯仿，使用震荡器震荡为乳糜样，12000rpm离心15min05、EP管内可见分为水样层，中间层和有机层，吸取上层水样层至新EP管内。6、加入500口1,异丙醇，上下混匀，室温静置lOmin,12000rpm离心15mino7、当心吸取上清，留下沉淀，加入75%乙醇（DEPC水配制）5OO|jL,弹起沉淀，12000rpm离心5min，再次吸去上清，加入75%乙醇（DEPC水配制）5OO|jL,12000rpm离心5min，吸去上清。滤纸吸干管口余液。必要时再次离心2-3min,10pL枪头吸取，打开EP管盖晾干。8、黄豆大小组织提取的RNA可加DEPC水5O|jL溶解后置于冰上，亦可依据组织块大小加入不同体积DEPC水溶解。9、打开DNA/RNA浓度测定仪，测定样品A260和A280值。可预先滴一滴水为空白对比，调整A260零点和A280零点。擦干比色杯中的水，加入混合匀称的RNA样液O.5pL,测定A260值及A260/A280比值,RNA浓度100ng/ml,比值为1.921,方满意试验要求。10、每管15RLRNA样液分装，放入-8CTC冰箱分装，避开反复冻融。细胞：1、取出EP管、做好标记，吸出或收集上清保存备用。2、用冷PBS冲洗细胞两次。3、加入1mlTrizol（24孔板每孔加0.5ml即可），调小刻度用移液器吹打细胞至液体澄清（或摇动混匀后室温孵育lOmin\4、余步骤同组织提取操作。四、留意事项1、尽可能使用无菌，一次性塑料制品。已标明RNase-Free的塑料制品，如没有开封使用过，通常没有必要再次处理。对于国产塑料制品，原则上都必需处理方可使用。处理方法如下：在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使DEPC的终浓度为0.1%。留意：DEPC为剧毒物，活性很强，当心在通风柜中使用。将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的全部部分都浸泡到溶液中。在通风柜中室温处理过夜。2、玻璃和金属物品可采纳250℃烘烤3小时以上灭活RNase。3、RNase广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA制备有关的分子生物学试验时,必需戴手套。一般状况下采纳用DEPC配制的75%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。取RNase-free的物品时必需戴手套。4、A260nm是核酸最高汲取峰的汲取波长，最佳测量值的范围为0.1至1.0。假如不在此范围，稀释或浓缩样品，使之在此范围内；假如吸光度小于0.05,检查是否存在操作因素（如移液不精确，样品内有悬浮物等）影响。核酸的吸光度必需大于0.1,其值才有效和牢靠。A280nm是蛋白和酚类物质最高汲