ev病毒c亚型重组病毒样

EV71病毒C4亚型重组病毒样颗粒诱导的中和抗体抑制吸附前及吸附后的感染。研究生：王新刚导师：孟继鸿教授精选课件精选课件前言：EV71是小RNA病毒家族中的肠道病毒属，拥有大约7.4kb的单正链RNA，正二十面体衣壳。病毒基因组非结构基因P2和P3区

结构基因P1区VP1、VP0、VP3。

VP2和VP4。病毒蛋白酶3CD空病毒衣壳精选课件EV71是手足口病的病原体，手足口病发生于5岁以内的儿童，过去几年里，在远东地区如，中国、越南、韩国呈暴发流行，引起严重的发病率和死亡率。感染EV71的个体常常显示轻微的症状，如在手、足及背臀部的水泡和发烧。一部分EV71感染者发展成严重的神经系统并发症，包括小儿麻痹症样瘫痪、脑干脑炎和肺水肿，最后导致死亡。精选课件没有特异的疫苗能够用于阻止EV71的感染。EV71分为三个基因型(A,BandC)，进一步分为11个基因亚型(A,B1–B5,andC1–C5)。因此，理想的EV71疫苗能够阻止大部分基因型感染。在所有研究EV71的疫苗中，病毒样颗粒(VLP)是最有前途的疫苗。在产量和安全方面都优于灭活疫苗。精选课件ChungYC,HoMS等用重组EV71病毒C2亚型病毒样颗粒能够在小鼠和猕猴中诱导产生高滴度的抗体。用EV71VLP免疫的雌鼠能够通过被动免疫给予新生小鼠免受EV71致死性感染。证明中和抗体在免疫防御中起了重要作用。然而，抗VLP抗血清在体外如何中和EV71病毒还不清楚。精选课件现在的研究是：用杆状病毒/昆虫细胞表达系统生产EV71病毒C4亚型的重组VLP。评价VLP在小鼠体内诱导中和抗体的能力。阐明抗VLP抗血清中和EV71的机制。精选课件材料与方法：一、细胞与病毒：实验中用的RD与Vero细胞（KuZ,ShiJ,LiuQ,HuangZ(2012)Developmentofmurinemonoclonalantibodieswithpotentneutralizationeffectsonenterovirus71.），EV71病毒C4亚型在RD细胞中增殖。根据Reed–Muench的方法以TCID50在RD细胞上滴定其浓度。纯化，灭活的病毒有hualan（中国河南）获得。精选课件二、衣壳亚单位蛋白特异性多克隆抗体抗-VP0豚鼠多抗抗-VP3多抗用与EV71有交叉反应的重组CAV16的VP3蛋白免疫豚鼠获得，用于检测EV71的VP3蛋白。抗-VP1多抗用大肠杆菌表达的重组EV71的VP1蛋白免疫兔子产生。精选课件三、载体构建从感染EV71病毒C4亚型的RD细胞抽提病毒RNA，随后用脱氧核酸引物和M-MLV反转录酶进行反转录。用cDNA作模板，扩增编码P1与3CD基因片段。P1片段的扩增引物(forward5,–AATCCATGGGTTCGCAGGTGTCT-3,andreverse5,-GACAAGCTTTCAAAGAGTAGTGATCGC-3,),用NcoIandHindIII酶切，然后插入到质粒pIExBac-1，成为pIExBac-P1精选课件3CD片段的扩增引物(forward5,-AATCCATGGGCCCGAGCCTTGATTTT-3,andreverse5,-GACAAGCTTTCAAAATAACTCGAGCC-3,),用NcoIandHindIII酶切,然后在同样位点插入到质粒pIExBac-1成为pIExBac-3CD.精选课件Figure1.Diagramsoftheconstructsusedinthisstudy.lef2,theleftsequenceforhomologousrecombination;hr5-Enh,AcNPVhr5enhancer;IE1-P,IE1immediateearlypromoter;p10-P,p10promoter;IE1-T,IE1terminator;1629,therightsequenceforhomologousrecombination.精选课件四、重组杆状病毒的产生。重组载体pIExBac-P1和pIExBac-3CD，经过转染，产生，选择和重组病毒的增殖。分别产生相应的重组病毒，也就是IExBac-P1和IExBac-3CD。Sf9细胞用重组杆状病毒感染，感染后72小时，收集感染的细胞和上清，用于分析。精选课件五、用ELISA和WesternBlot分析表达的蛋白杆状病毒感染的Sf9cells用

Tris–NaClbuffer12,000rpm离心5min获得蛋白溶解产物.（一）间接ELISA：包被：5ul蛋白产物用50ulPBS稀释,包被96孔酶标板4℃12h;用PBST(1×PBS，0.05%Tween20)洗涤三次.封闭：用5%牛奶PBST200ul/孔37℃

1h一抗：第一抗体(豚鼠anti-VP0抗血清,兔anti-VP1抗血清或者豚鼠anti-VP3抗血清)用1%奶粉的PBST以1:1000稀释，以50ul/孔37℃2h。精选课件二抗：标记的第二抗体(1%奶粉PBST以1:3000稀释)以50ul/孔

37℃1h.显色：TMB混合物以50ul/孔

5–10min;然后

50ul/1NH3PO4终止.450nm测吸光度。

（二）Westernblotting,以12%聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白然后转移至PVDF膜.用抗原特异一抗结合抗原，HRP-连接的第二抗体.用BeyoECLPluskit(Beyotime,Shanghai,China)的化学发光试剂显示膜上的阳性标本，用

LAS-4000冷光成像分析器记录。精选课件Figure2.CoexpressionofP1and3CDofEV71ininsectcells.Lysatesfromthebaculovirus-infectedSf9cellswereanalyzedbyELISAwith(A)anti-VP0,(B)anti-VP1,or(C)anti-VP3polyclonalantibodies,精选课件(D)byWesternblottingwiththeanti-VP0polyclonalantibody.Sf9,mock-infectedSf9celllysate;P1,lysatefromtheIExBac-P1infectedcells;3CD,lysatefromtheIExBac-3CDinfectedcells;P1+3CD,lysatefromcellsinfectedwithbothIExBac-P1andIExBac-3CD.ErrorbarsrepresentSE.精选课件六、VLPs与对照抗原的制备ToevaluateVLPassembly,theP1/3CDco-infectedcelllysatewassubjectedtosucrosegradientsedimentation杆状病毒感染Sf9的溶解产物在20%的蔗糖缓冲液中以25,000rpm超速离心6h。合成的球状物用PBS重悬，然后分层于10–50%之上39,000rpm超速离心3h。从顶到底的片段用SDS户Westernblotting分析，富含VLP的层用PBS浓缩、透析，然后在20%蔗糖缓冲液中超速离心。VLPs用PBS重悬，然后用于动物免疫。用Westernblotting检测VP0含量作为参考标准定量VLPs。未感染的Sf9溶解物如同纯化VLP一样处理，作为阴性对照抗原，用于免疫。精选课件Figure3.Sucrosegradientanalysis.Lysateswerelayeredonto10–50%sucrosegradientsforultracentrifugation.Tenfractionsweretakenfromtoptobottom.(A)SDSanalysis.ThetenfractionswereseparatedbySDS,andsubsequentlystainedwithCoomassieBluedye.M,proteinmarker.EV,purifiedwholevirionEV71standardfromHualanInc.精选课件(B)Westernblottingwithanti-VP0polyclonalantibody.(C)Westernblottingwithanti-VP1polyclonalantibody.(D)Westernblottingwithanti-VP3polyclonalantibody.精选课件七、电子显微镜VLP样本用0.5%水样乙酸双氧铀负染,用PhilipsCM-12S放射电子显微镜观察。精选课件Figure4.ElectronmicroscopyofEV71VLPs.PartiallypurifiedVLPswerenegativelystainedwith0.5%aqueousuranylacetateandvisualizedbytransmissionelectronmicroscopy.Bar=50nm.精选课件八、VLP免疫小鼠诱导出抗EV71特异的抗体反应免疫之前,EV71VLPs与同样制备的阴性对照(Sf9)抗原与明矾(Pierce,Rockford,IL,USA)根据厂商说明，以体积比1:1混合，混合物含有VLPs(相当于5mgVP0)或者Sf9阴性溶解产物.每组5只雌性Balb/c小鼠(6–8weeksold)以

0,2和5周次腹腔注射。每次免疫之前，收集血清样本，

在第七周老鼠被处死。血清保存在-80℃备用。精选课件九、抗体测定：用间接ELISA测定血清样本中抗-EV71抗体的反应性。包被：灭活的EV71(10ng/孔)包被96-孔ELISA反应板

37℃3h.封闭：用5%奶粉PBST孵育37℃1h.加血清：用1%奶粉PBST稀释血清样本37℃2h。二抗：HRP连接抗小鼠IgG抗体37℃1h。显色：显色，450nm测量OD值。精选课件Figure5.AntibodyresponsesfollowingVLPimmunization.Groupsoffivemicewereinjectedi.p.atweeks0,2and5,withalumabsorbedantigens:EV71-VLPequivalentto5mgVP0,orthecontrollysatesimilarlypreparedfromuninfectedSf9cells.Theimmunizedmiceweresacrificedatweek7(2weeksafterthelastimmunization),andtheserum,bonemarrowandspleensampleswerecollectedandassayed.Resultsarerepresentativeoftwoindependentexperiments.(A)EV71-specificserumIgGtitersoftheSf9andtheVLPgroups.Eachsymbolrepresentsamouse,andthelineindicatesthegeometricmeanvalueofthegroup.精选课件十、斑点ELISA分析在最后免疫之后的第三周，收集三只免疫小鼠的脾脏和骨髓，做B细胞ELISPOT。分离脾细胞和骨髓细胞,浓缩、计数。96孔PVDF板(Millipore,Billerica,MA,USA)用纯化灭活的EV71以100ng/孔预先包被，4℃孵育过夜。PVDF板用完全RPMI1640培养基37℃封闭2h。新鲜分离的脾细胞和骨髓细胞(1×105/孔)在5%CO2中37℃孵育40h。用1%FBS和0.05%Tween-20的PBS缓冲液稀释生物素化的山羊抗-小鼠IgG，以0.1ug/孔加入到

PVDF板中，37℃2h。然后用PBS以1:1000稀释碱性磷酸酶链接的链霉亲和素37℃1h。精选课件用水冲洗6次,加NBT/BCIP酶底物100ul/孔孵育20min显色。用水冲洗终止显色，然后晾干。

抗体分泌细胞的斑点用CTL免疫斑点器成像计数精选课件Figure5.AntibodyresponsesfollowingVLPimmunization.(B)ELISPOTanalysisofEV71-specificantibody-secretingcellsinmousebonemarrow.Samplesfromnaı¨vemicewereusedasthecontrol.Resultsoftriplicatewellsareshown.(C)ELISPOTanalysisofEV71-specificantibody-secretingcellsinmousespleens.Samplesfromnaı¨vemicewereusedasthecontrol.Resultsoftriplicatewellsareshown.精选课件十一、中和能力血清样本用含有2%FBS的DMEM培养基以2倍倍比稀释。EV71稀释到2TCID50/ul的工作浓度。中和试验在96孔板中进行，50ul稀释的抗血清与50ul含有100TCID50的EV71混合加入到每孔中37℃1h。然后，100ul中含有15,000RD细胞的细胞悬液

was加入到含有病毒与抗血清混合物的孔中，5%CO2中37℃培养。3天之后观察并评价CPE。能够完全保护细胞没有出现CPE的最高血清稀释度为中和作用的滴度。精选课件Figure6.VLP-immunizedseraefficientlyneutralizedEV71infectioninvitro.NeutralizationtitersoftheantiseraweredeterminedbyTCID50reductionassay.TheantiseraoftheSf9groupdidnotshowanyneutralizationat1:32(thelowestdilutiontested)andwerethereforeassignedatiterof16forGMTcomputation.Eachsymbolrepresentsamouse,andthelineindicatestheGMTofthegroup.Resultsarerepresentativeoftwoindependentexperiments精选课件十二、肽ELISA用含有VP1整个区的58个合成肽镶嵌板做ELISA检测抗VLP抗血清的反应性。抗血清显著地与43#肽(FGEHKQEKDLEYGAC)反应,与以前鉴定的SP70表位(YPTFGEHKQEKDLEY)重叠。43#肽定位于VP1蛋白的GH环。Figure7.Neutralizingantibodiesintheanti-VLPserapredominantlytargetanepitopelocatedintheGHloopofVP1protein.(A)MappingofimmunodominantB-celllinearepitopeswithintheVP1protein.Thepooledanti-VLPserawereanalyzedbyindirectELISAforreactivitywithapanelof58syntheticpeptidescoveringtheentiresequencesofVP1.精选课件为了鉴定这个表位在产生中和抗体中的作用。43#肽以不同浓度与中和抗体混合做中和实验，43#肽以剂量依赖的方式降低了中和抗体的中和作用，而对照HIV肽没有干扰中和作用。证明中和抗体的目标表位在43#肽序列。(B)Neutralization-inhibitionby#43peptide.Theanti-VLPserawereincubatedwith#43peptideoranegativecontrolpeptide(fromHIV)atdifferentconcentrationsfor1hourat37℃.Thepeptide/antiserummixturesweresubjectedtoneutralizationtesting.Neutralization-inhibitionbythepeptideswasdeterminedusinganMTTmethod.Dataaremeans+DoftheOD490readingsoftriplicatewells.精选课件十四、吸附前试验抗血清用含有2%FBS的DMEM培养基系列稀释,8ul稀释的血清与对照培养基加入到400ul含有9×106TCID50的EV71基因亚型C4中，37孵育1h。混合物加入到3.5×105/孔的RD细胞和Vero细胞的12孔板中。4孵育1h。细胞用冷PBS冲洗三次。收集细胞，用抗-EV71和抗-actin的多克隆抗体做westernblotting.精选课件Figure8.InhibitoryeffectoftheantiseraonEV71attachmenttocells.Antiseraatdifferentdilutions(1:50,1:500,and1:5,000)weremixedwith400mlofEV71containing9×106TCID50,andincubatedfor1hourat37℃.Themixtureswereaddedto(A)RDor(B)Verocellsforincubationfor1hourat4℃toallowvirusattachmenttothecells.Afterincubation,thecellswerewashedwithcoldPBS