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文档简介

聚丙烯酰胺凝胶电泳

PolyacrylamideGelElectrophoresis，PAGE

LiLi

一、PAG的组成

PAG是由丙烯酰胺（acrylamide，Acr）单体和N，N’-亚甲双丙烯酰胺（N，N，N’，N’-methylenebixacrylamide，Bis）交联剂通过自由基聚合而成的一种多孔三维网状结构。Acr+Bis

多孔三维网状结构

（1）丙烯酰胺结构式

二、PAG的聚合

需要催化剂——氧化还原系统作用，使Acr单体带有游离基，从而与Bis进行聚合。

（一）化学聚合：AP-TEMED系统

过硫酸胺[(NH4)2S2O8]（Ammoniumpersulfate，AP）作为催化剂，四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。

（二）光聚合：核黄素-TEMED系统

核黄素（riboflavin）在光照下（可见光或紫外光）分解，其黄素部分被还原成无色型，但在有氧条件下无色型又被氧化成带有游离基的黄素，其也能使Acr和Bis聚合形成凝胶。注意：分离胶的合成一般采用化学聚合。因为若用光聚合，凝胶的孔径受光照强度与时间的影响，导致孔径大小不同，从而影响蛋白质的分离。

三、PAG的浓度与孔径的关系

PAG孔径的大小主要由Acr和Bis这两种单体的浓度决定。可以根据要分离物质分子的大小，选择合适的单体浓度。Acr/Bis：20~40完全透明且有弹性；＜10很脆，易碎，不透明；＞100糊状不成形，易破碎。

凝胶总浓度T——100ml凝胶溶液中含有Acr和Bis的总克数。T=（a+b）/m×100%T越大，凝胶孔径越小，适用于分离分子量较小的物质。T越小，凝胶孔径越大，适用于分离分子量较大的物质。

四、不连续PAGE

按具体操作分垂直板形电泳圆盘电泳按凝胶系统的均匀性分连续PAGE

不连续PAGE

Disc

成分作用样品胶T=3%C=20%单体欲分离的样品溶液pH6.7Tris-HCl缓冲液混在一起，用光聚合方法聚合而成的大孔凝胶有防对流作用电极槽缓冲液通常为pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液

Disc成分作用浓缩胶除不加样品外，其余组成成分同样品胶相同样品在此胶中被浓缩

分离原理

1.浓缩效应1）凝胶层的不连续性两层凝胶T与C不同孔径不同浓缩胶孔径大，分离胶孔径小，蛋白质在大孔径浓缩胶中移动，受阻力小，移动速度快。

2）缓冲液离子成分的不连续性甘氨酸（pI=6.0）在pH8.3带负电，朝正极移动，进入浓缩胶（pH6.7），甘氨酸解离度（）很小，有效迁移率（M）很低，移动速度较慢，称为慢离子。HCl

是强电解质，=1，Cl-有效迁移率大，移动速度快，称快离子。蛋白质（pI＜6.0）带负电荷，有效迁移率介于两者之间。

pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液

甘氨酸HCl蛋白质样品胶浓缩胶分离胶样品低电导区

3.分子筛效应与电荷效应进入分离胶后，Gly-成为快离子分离胶只有电荷效应和分子筛效应，根据各蛋白质所带电荷不同、分子大小不同而分离

五、PAGE的特点

1.具有分子筛效应，分辨率高2.样品不易扩散，用量少，灵敏度可达

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