华大结题报告3蛋白3.4mrm模板

字体说 MRM目标蛋白工作流 MRM定量原 MRM信息分析流 标准信息分析流 MRM实验方法的建 目标蛋白质的选 Transition的验证与仪器优 MRM样本定量分 MRM离子峰值整 重复性分 样本校 目标蛋白质的定量结 文件...............................................................................................................................文件格式说 目标蛋白实验方法的建 目标蛋白验证及定量分 6 7参考文 1.1符号名 符号说 小四字 五号字 正小五字 目标蛋白工作流程MRM质谱多反应监测(multiplereactionmonitoring,MRM)[1]是一种应用于目标蛋白组学定量的质谱技术，它基于蛋白质已知的信息或假定的信息有针对性地获取数据进行质谱信号采Quadrupole Quadrupole QuadrupolePrecusor

Fragmention

Retention2.1MRM该图显MRM质谱技术的主要工作原MRM质谱模式中，第一级和三级(Q1，Q3)作为质量过滤器，选择特定m/z的肽段母离子与子离子通过，第二级四极杆(Q2)Q1选择的肽段母离子碰撞碎裂生成子离子。质谱transition即母/子离子对)实时监控并检测信号(Detector，就形成了一系列色谱峰图，色谱峰图以保留时间为横坐标，子离子信号强度为(5个数量级)，这一优势使得MRM现在被越来越多应用在检测复杂混合样本中的低丰度蛋白、MRM不不合质量合酶SDS电试剂盒定还原烷基蛋白质提质量LC-MRMLC-MRM图2.2MRM实验流程该图显示了MRM目标蛋白质实验的基本流程，第一步首先从样品中提取蛋白，第二步对提取后的蛋白样品进行还原烷基化的处理，打开二硫键以便后续充分酶解蛋白。第三步，用GE公司定量试剂盒(2Dquantkit)进行蛋白质的浓度测定。第四步，等体积进SDS电泳。蛋白定量合格则进行下面实验步骤，不合格则重新提取蛋白。第五步，蛋白酶解消化。第六步，用样本建MRM方法，方法成功则可对样本进行LC-MRM质谱分析。 合合控图2.3MRM信息分析流程该图显示MRM信息分析的基本流程，第一步，利用组或者蛋白质组的相的代表肽段。第三步预测可行的transitions。第四步对预测的transitions进行验证，挑选，如果transition验证整合结果形成MRM实验方法列表，虚线所框为MRM方法建立的流程。第七步，对实验下机质谱数据进标准信息分析流MRM不同于其它蛋白质组学研究方法，MRMtransition的信号来进可能会形成几个至几十个子离子。MRM只选择部分有代表性的transitions进行信号监测。因此在MRM实验前需选择合适的transition，这就是MRM实验方法的建立。MRM实验方号区分。建立最优的transitionsMRM实验成功的关键。实验方法的建立我们主要使用的辅助软件为proteinpilot(AppliedBiosystems)与Skyline[3](skyline425)。目标蛋白质的选白数据库用来后续选择unique肽段，此次项目的数据库为IPI大鼠的蛋白数据库。3.1目标蛋白IDProteinProteinProtein1 ;Rps1840Sribosomalprotein2-Uncharacterizedprotein3LOC68878460Sribosomalprotein4Fhl3Uncharacterized56-Uncharacterizedprotein7LOC314016Melanoma-associatedantigenMG508Rpl760Sribosomalprotein9Serine(Orcysteine)peptidaseinhibitor,cladeF,member1,isoformRplp060SacidicribosomalproteinRps1440SribosomalproteinPeroxiredoxin-fourandahalf sprotein1isoformFibrillin-Isoform1ofFibrinogenbetaHbb-b1Zerobeta-1Rpl1760SribosomalproteinSerpind1HeparincofactorRpl10lUncharacterized LOC497813;Rps740SribosomalproteinRps24Isoform1of40SribosomalproteinRps2540SribosomalproteinCarbonicanhydraseRpl1860SribosomalproteinRpl2460SribosomalproteinGuaninenucleotide-bindingproteinsubunitbeta-2-likeRps840SribosomalproteinRpl1560SribosomalproteinAquaporin-Ctnna1UncharacterizedCtnnd1UncharacterizedCarbonicanhydraseKeratin,typeIIcytoskeletalRasal1.UncharacterizedRpl7a60SribosomalproteinSecerninAspnUncharacterized Cyc1UncharacterizedIsoform2of-UncharacterizedRps1640SribosomalproteinKrt75keratin,typeIIcytoskeletal 40SribosomalproteinS4,XKng1Uncharacterized Sh3bgrUncharacterizedLOC362795Ig -2CchainCGdaUncharacterizedRps5UncharacterizedRtn2Uncharacterized keratin6A-Transition的选离子。在选择肽段的transitionunique，在样本背景中能唯m/z小于1250，y型子离子、肽段无转录后或化学修饰、无漏切位点等都是选择最优的肽段，每个肽段选择4~6个transitions。 的验证与仪器优化于肽段的质谱偏、样本背景的复杂性，蛋白过原因，预选择的transitions也可能会出最优的transition进行MRM实验。TransitiontransitionMRM+EPI的质谱模式进行验证，MRMtransitionEPI模式(EnhancedProductIonScan)。EPIMS/MS谱，用来鉴定验证对应的肽段。MRM+EPItransition色谱峰进行验证，肽段MS/MS鉴定的保留时间与transitionMRM色谱峰的保留时间进行匹配，就能去除可能存在的假阳性干扰峰[1]，如下图所示为MRM+EPI模式验证transition的示例。3.1Transition的验证MRM+EPI模式对目标肽段AITGASLADIMAKtransition进行实验验证。由图可以看，到目标肽段AITGASLADIMAK选择的transition631.34/761.42MRM验证时检测到A(保留时间肽段IQAVLLPK，峰B的保留时间内鉴定到肽段AITGASLADIMAK，峰C时鉴定到肽段 ----

--------3.2是对肽段进行MS/MStransitionsMRM验证的结protein，peptide分别表示目标蛋白及相应的肽段，MS/MSConf，MS/MSRT/min分别表示肽段鉴定的可信度与保留时间，空白表示没有鉴定到，confidence20表示肽段可靠鉴定到。MRMRT/min表示肽transitionsMRM验证中色谱但至少3transition有一致MRM色谱峰保留时间的可作为定量的候选肽段。肽transitions色谱峰保留时间不一致的不可用于MRM定量实验，未列入表中。模式的质谱，选取使transition达到最好响应信号的CE，此CE值即为最优CE值。此项目transition5CECE的过程，检测在不同CE梯度下同一个transition信号强度。图3.2为蛋白IPI 子离子的保留时间，纵坐标为离子信号强度。不同颜色表示在不同CE值条件下的保留时间-信号强度的关系。由图可以看到，在蓝色所示的梯度CE值下transition峰信号最好的CE值，故选蓝色所示的CE值为transition661.86/940.55的实验最优CE参数。2unique肽段，每个肽段保留3个预测最优的transitions。一般一个目标蛋白最终产生成6个transitions。经过验证和优化的transitionMRMtransition结果表。Protein Signature

MRMTransitions

IonESEITYF ESEITYF IA IGP 000VDS VDS3.3展示了目标蛋白最终方法transition列表。其中Protein为目标蛋白名称，SignaturePeptide为CE(CollisionEnergy)为碰撞能量。FragmentIonType为选择的子离子类型。Transition列表见输出文件MRM离子峰值整MRM(wiff格式)MRM分析软件MultiQuantAppliedtransition的色谱峰图信息。图3.3同一肽段的transitions色谱峰信息横坐标为其保留时间(min)，纵坐标为离子强度。由图可以看到，同一肽段的三个子离子y13+、y7+、y6+均有对应的色谱峰，并且保留时间一致。信息。下图显示的是transition色谱峰整合后的部分列表结果，整合后的离子峰值信息将进3.4MRMComponentMassSignal1542.31542.31542.3/1671.31671.31671.31 0838.51 838.51 559.31 508.31 508.31 508.31 624.81 624.81 624.81 597.9/1 597.91 597.91 452.81 452.81 452.81542.31542.31542.3/1671.31671.31671.31 0838.51 838.51 559.31 508.31 508.31 508.31 624.81 624.81 624.81 597.9/1 597.91 597.91 452.81 452.81 452.8要是通过分析比较transition离子峰面积及SignalNoise数据来定量分析。Used逻辑值表示同一肽段的transitions保留时间是否一致。果见输出文件对峰值整合结果中的各肽段对应transitions的保留时间进行统计，结果如下表：3.5transition

1212341234▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲

▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲××××××××▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲表3.5是对8次测量中各肽段transitions保留时间的统计。×:表示属同一肽段的所有transitions无一致的保留时间，不适合用于定量分析，仅作验证数据，如IPI .GEEVTILAQK。▲:表示同一肽段的所有transitions保留时间一致，满足定量分析要求。重复性分析transition测量的一致性。这里重复性分析提供3.4transitions各次重复的平均峰面积与其CV关系。3.4transition峰面积&CVtransition在每个样本四次重复中的峰面积平均，纵坐标为这四个样本校Beta-galacOS=Escheri作为参考蛋白，用来校准由于进样、仪器等误差造成的实验偏差。样本校准前后各transition峰面积CV比3.5transitionCV比较sample1_raw，sample2_raw，sample3_raw为sample1，sample2，sample3未校准的原始数据sample1_nor，sample2_nor，sample3_nor为对应样本校准后的数据。纵坐标表示样transitions的峰面CV范围。由图对比可以看到，样本校准后相比校准前，CV范围有明显下降，这说明加入内参蛋白起了很好的校准作用。目标蛋白质的定量结果3.62PeptidefoldProteinfoldBeta-galacOS=EscheriBeta-galacOS=Escheri 本示对应差异倍数。Proteinfoldchanges为最终蛋白水平上的差异，如图红色所示，为有显著差异的蛋白，图中绿色表示是蛋白差异显著可靠，对应ratio为显著差异的差异倍数，可作为衡量蛋白的显著差异。 3.6上图显示在样JMP，NL中的表达有显著差异的目标蛋白及差异倍数。横坐倍数，图中虚线所示差异倍数为1，大于1表示此蛋白上调，小于1表示蛋白下调。文件Host:ID:Unix/Linux用户：tar–zxvf*.tar.gzorgzip–d*.gz。Windows用户：推荐使用winRAR进行。Mac用户： :tar–zxvf*.tar.gz 文件格式说明目标蛋白实验方法的建立5.1transition5.1*.transition.xlsSignatureMRMIon Ion 目标蛋白验证及定量分析5.2*.integrated_peak.xls5.2*.integrated_peak.xls表 含Original Component Mass Retention Widthat 6CustomerService:cus TechnicalSupport: Comint 7Lange,V,Picotti,P.etal.Selectedreactionmonitoringfortativeproteomics:atutorial.MolSystBiol.(2008)4:222.Kettenbach,A. Rush,J