淋巴细胞转化实验课件

淋巴细胞转化实验09.12.21淋巴细胞在体外培养时，受到刺激物的刺激后可表现为细胞体积增大、代谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加，即向淋巴母细胞转化和增殖。此现象称为淋巴细胞转化现象（简称为淋转）。淋巴细胞转化率的高低可以反映机体的免疫水平，因此可作为测定机体免疫功能的指标之一。原理T细胞、B细胞表面具有抗原识别受体和有丝分裂原受体★植物血凝素（PHA）、刀豆蛋白A（ConA）可选择性刺激T细胞增殖；★脂多糖（LPS）可刺激B细胞增殖；实验流程

－－PBMC的分离基本原理：由于血液标本中各种细胞比重不同，红细胞、中性粒细胞比重为1.092，单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）比重为1.075－1.090；Ficoll比重为1.077±0.001。将血液标本置于分层上，经离心沉淀，比重高的红细胞、多核白细胞沉于管底，而比重小的淋巴细胞和单核细胞悬浮于血浆和分层液的界面层中。←ＰＢＭＣ←淋巴细胞分离液←红细胞、粒细胞、血小板←血浆实验流程

－－淋巴细胞转化实验基本原理：在特异性抗原刺激下可使相应淋巴细胞克隆发生增殖；有丝分裂原可作为多克隆刺激剂，使相应淋巴细胞发生增殖。（四）3H-TdR掺入法：3H-TdR即胸腺嘧啶核苷，是DNA合成的前体。加入细胞培养液中后被细胞摄取作为DNA合成的原料。细胞合成的DNA越多，则所掺入的3H-TdR就越多。该方法与MTT比较，灵敏度高、准确性好。（三）CCK-8(CellCountingKit-8)法:原理同ＭＴＴ法。是ＭＴＴ的升级替代产品，可被还原成橙黄色的甲臜，且为水溶性。本方法重复性好，灵敏度高，对细胞的毒性低。

实验流程

－－结果观察取静脉血3ml,用PBS（吸管1）稀释1倍（滴管1）将稀释好的静脉血沿管壁缓慢加入到淋巴细胞分离液（3ml）的上方（滴管1）,2000rpm,20min将滴管（滴管2）插入到白膜层，吸取单个核细胞层，转移至另一离心管中，加入PBS（吸管1）至5ml,1500rpm,10min.弃上清，再洗涤细胞1次（吸管1）（滴管2）.离心之前计数细胞弃上清,加入完全培养基（吸管2）,重悬细胞（滴管2）.将细胞浓度调整为2*106个/ml.将细胞加入96孔板（加样枪）,100ul/孔A组：加入不同浓度的ConA,100ul/孔.每个浓度为2复孔.留2个孔仅加入培养基，作为空白对照.

B组：加入100ulConA(10ug/ml),则终浓度为5ug/ml.4复孔.设空白对照.实验步骤细胞数/ml＝4大格中细胞总数4×104

×稀释倍数ConA的倍比稀释10ug/ml5ug/ml2.5ug/ml450µL440µL220µL220µLOriginalsampletubetube1tube2220µL注意无菌操作操作中尽可能短时间内完成，以减少死细胞数将稀释血加于分离液时，动作要轻柔离心时，加速度与减速度要均匀平稳，不能用离心机“刹车”档分离不同种属动物的PBMC要用不同的淋巴细胞分离液细胞数量、刺激剂浓度需要在预实验中摸索最适条件注意事项细胞培养概述细胞培养（cellculture）：从体内取出组织或细胞，在体外模拟体内的生理环境，在无菌、适宜温度和一定营养条件下使其生长，并维持其结构和功能的方法。细胞培养技术是生命科学中常用的研究手段，亦是生命科学各研究领域的基础技术和基本技能。细胞培养实验的基本要求实验前准备：超净台紫外线消毒30min；无菌室每周消毒1-2次；所用器材要经过严格消毒；操作前用消毒液浸泡手或用75%酒精擦拭。实验中要求：

Ω一切操作均要在火焰前方进行；瓶口、吸管使用前要经过火焰消毒后使用。

Ω试剂瓶的瓶口应斜放在支架上，试剂用后立即封闭瓶口。

Ω专管专用。Ω手不要从敞开的瓶口上方经过。实验后要求：关闭超净台风机；用酒精纱布擦拭超净台台面，紫外线消毒。细胞培养条件合成培养基：根据体内细胞生存所需的物质种类和数量，用化学物质模拟合成。常用的培养基有RPMI-1640、DMEM、IMDM等。血清：胎牛血清、新生牛血清、小牛血清。抗菌素：抑制可能存在的细菌和霉菌的生长，而不影响细胞的生长。常用青、链霉素；庆大霉素等。消化液（培养贴壁细胞用）：0.25%胰蛋白酶、EDTA液pH调整液NaHCO3溶液：常用浓度为5.6%和7.4%Hepes液：可较长时间保持较强的缓冲作用培养条件：无菌、３７℃、５％ＣＯ２细胞的冻存、复苏与运输细胞的冻存10％DMSO（低温保护剂），20％以上的血清，其余为培养基，细胞数1×106个-1×107个。二步冻结法。细胞的复苏

从液氮罐中取出的冻存管，迅速投入37℃水浴中充分摇动，使其迅速融化。加入培养液离心后，弃上清，加培养液培养。细胞的运输

长距离运输：补充培养液至瓶颈部，保留微量空气，拧紧瓶盖；瓶口用胶带密封，并用棉花包裹作防震、防压处理。细胞培养常见污染及处理方法细菌污染