核酶优秀公开课课件

第十二章核酶第一节ribozyme第二节脱氧核酶第一节ribozyme一、ribozyme的发现二、ribozyme的概念三、ribozyme的种类四、ribozyme研究进展与展望20世纪80年代初期，美国科罗拉多大学博尔德分校的T.Cech在研究四膜虫rRNA前体的剪接时发现，其26SRNA具有自我催化活性，由此提出了核酶的概念。美国耶鲁大学的S.Altman在大肠杆菌中发现了RNaseP具有生物催化功能，从而改变了生物催比剂的传统概念。为此，T.Cech和S.Altman共同获得了1989年度诺贝尔化学奖。一、ribozyme的发现二、ribozyme概念概念：具有催化功能的RNA分子，是生物催化剂。又称核酸类酶、酶RNA、核酶类酶RNA。特点：核酶的作用底物可以是不同的分子,或者作用底物是同一RNA分子中的某些部位。与蛋白质酶相比：核酶的催化效率较低，是一种较为原始的催化酶。打破了酶是蛋白质的传统观念。

核酶的功能：

1.

核苷酸转移作用。

2.

水解反应，即磷酸二酯酶作用。

3.

磷酸转移反应，类似磷酸转移酶作用。

4.

脱磷酸作用，即酸性磷酸酶作用。

5.

RNA内切反应，即RNA限制性内切酶作用。三、Ribozyme的种类根据作用方式分为：剪切型（把RNA前体的多余部分切除），剪接型（把RNA前体的内含子部分切除并把不连续的外显子部分连接起来）根据所作用的底物不同分为：自体催化（催化分子内反应）异体催化（催化分子间反应）根据核酶的结构和催化反应：RNA和蛋白质复合物：核糖核酸酶P。小分子的RNA：能够进行分子内自我切割反应，且不需蛋白质参与。这些RNA分子可以分为两个部分，一部分是底物，另一部分是酶。将具有酶活性的序列克隆后可制成人工核酶去作用于独立的底物。Ⅰ、Ⅱ型内含子：将自身从前体mRNA中剪接出去的作用共同点：都涉及磷酸二酯键的切割或连接。它们作用的底物是RNA，可以是RNA分子本身，也可以是别的RNA分子。

几种能进行自我剪切的RNA结构

小分子核酶常见类型：锤头、发夹、HDV催化特点：产生5-OH、2,3-环状磷酸基末端I型内含子剪接，图中的pG可以是GTP、GDP或是GMP特点：I型需要游离的鸟苷或其磷酸化的衍生物的参与，剪接过程中，内含子先以线性形式被释放，然后再转变成一个片段和一个环状分子。四、Ribozyme研究进展与展望对各种已知ribozyme结构与功能关系的研究。可找出其结构功能域和必需基团，据此可进行分子改造，以获得分子更小的、高效的ribozyme。研究热点：从催化分子内反应的自我剪切ribozyme设计出催化分子间反应的ribozyme。1、抗病毒方面的研究HIV是一种逆转录病毒，是核酶应用研究的理想靶标。HIV主要攻击T淋巴细胞，破坏机体的免疫系统，使抗病能力降低，导致死亡。Wong等(1998)利用发卡型核酶抑制HIV-1基因表达，在一期临床试验中，用带有发夹状核酶的载体体外转染患者的T细胞,然后再将这些T细胞重新输入到患者体内，结果显示患者体内HIV-1的滴度降低。在的二期临床试验中，Mitsuyasu等(2009)用逆转录病毒载体将抗HIV核酶导入到造血干细胞中，然后将造血干细胞注入到感染HIV的患者体内，结果38名患者携带了该种疗法所使用的完整拷贝。研究结果发现,CCR5是HIV-1R5毒株的重要细胞复合受体之一，该受体在HIV-1感染初期起重要的作用，但是它的缺失对宿主是无关的，因此CCR5可作为核酶切割的理想靶点。

HBV是一种逆转录病毒。其生活史如下：

HBV进入肝细胞在宿主酶作用下以负链DNA为模板合成正链DNA形成共价闭合环状DNA在宿主RNA聚合酶作用下合成mRNA(亦称前基因组RNA,pgRNA)在HBV逆转录酶作用下合成负链DNA在HBVDNA聚合酶作用下合成正链DNA形成子代闭合环状DNA。由于HBV的复制必须经过RNA的过程，所以可设计特异性核酶用于切割RNA，从而阻断HBV的复制过程。2、核酶的抗肿瘤作用针对多药耐药性基因设计核酶多药耐药性(multidrugresistnce,MDR)是指肿瘤细胞对一种化疗药物表现出耐药性，同时对其他许多结构不同、作用靶点亦不相同的化疗药物也表现出交叉耐药的现象，是通过化疗药物治疗肿瘤急需突破的一大难题。Hiroyuki(1993)设计一个特异性切割MDR1mRNA序列的锤头状核酶，在体外对MDR1mRNA进行切割，显示锤头状核酶能切割MDR1mRNA且使MDR恢复显性。Wang等(2003)设计并合成一个抗MDR1的锤头状核酶，由一个含有RNA聚合酶П启动子的逆转录病毒载体将其输送到人肝癌细胞系HepG2中，结果显示转染了锤头状核酶的细胞对阿霉素敏感，并有MDR1表达量的降低。这说明无论用逆转录病毒载体还是用脂质体转染抗MDR1的核酶都有可能有选择的适用于MDR的治疗。Gao等(2007)在体外使重组核酶仅在乳腺癌细胞中表达，而在非乳腺癌细胞中不表达；化学敏感性评估结果显示在经转染的细胞中，对阿霉素的抗药性降低了15倍,对长春花碱的抗药性降低32倍。核酶展望核酶能切割致病基因的mRNA，通过使其mRNA断裂来抑制致病基因的翻译及表达，从而达到预防及治疗疾病的目的；核酶具有高度的特异性,它只对能与其互补的mRNA发挥切割作用，而对宿主细胞没有任何副作用，因此它是极安全的基因治疗工具。第二节脱氧核酶一、概念利用体外分子进化技术合成的一种具有有高效的催化活性和结构识别能力的单链DNA片段。同单链RNA分子一样，能进行折叠、催化和展现酶活性。未发现自然界中存在天然的脱氧核酶。根据催化功能的不同，可以将脱氧核酶分为5大类：切割RNA的脱氧核酶、切割DNA的脱氧核酶、具有激酶活力的脱氧核酶、具有连接酶功能的脱氧核酶、催化卟啉环金属螯合反应的脱氧核酶。脱氧核酶分子的构建是通过扩增事先固定在固相载体上的具有自我裂解功能的活性分子实现。1、建立具有多样性的DNA分子库，其中的每一条分子两端的序列固定；2、利用针对这些序列的PCR引物进行扩增。设计引物时，使PCR产物的一条链上5’-C端带上生物素,并插入一个三磷酸核苷，将这些嵌合分子通过5’-C端的生物素固定在固相载体上，给予一定的条件使其进行自我裂解；3、具有裂解功能的分子