流式细胞术贝克曼

流式细胞术贝克曼第一页，共二十三页，2022年，8月28日1.检测淋巴细胞亚群，监测细胞免疫状态2.白血病/淋巴瘤免疫分型3.HLA组织配型及HLA与某些疾病的关系4.干祖细胞的定量及成分分析.5.其它:粘附分子;TCR多态性检测;肿瘤癌基因及抑癌基因蛋白产物的检测;细胞内酶;耐药蛋白的分析等等。第二页，共二十三页，2022年，8月28日

临床应用疾病诊断:为疾病诊断提供直接的或支持诊断的依据免疫调节：细胞因子/受体的相互作用共刺激分子受体/配体的相互作用

发病机理：肿瘤的发病与机体的免疫力低下、以及信号传递障碍有关药物/疫苗效果的评价：肿瘤生物治疗的时机选择、以及效果的监测免疫状态评价：移植、放化疗等.第三页，共二十三页，2022年，8月28日细胞周期分析:在细胞周期(G0，G1，S，G2，M)的各个时期，DNA的含量随各时相呈现出周期性的变化。通过核酸染料标记DNA，并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1%，S%及G2/M%。了解细胞的周期分布及细胞的增殖活性。也可利用细胞周期蛋白（CYCLIN）、Ki67、核增殖抗原（PCNA）等，对细胞周期进行精确的分期：G0、G1、S、G2、M.DNA含量及细胞周期分析第四页，共二十三页，2022年，8月28日G2MG0G1s0

200

400

600

8001000G0G1sG2MDNAAnalysisDNAcontentCount2N4NNormalCellCycle第五页，共二十三页，2022年，8月28日1.肿瘤的早期诊断。2.肿瘤的良恶性判断。3.观察细胞的增殖状态及周期分布。4.疗效监测第六页，共二十三页，2022年，8月28日细胞功能分析

1.吞噬功能试验

2.氧爆发试验3.根据T淋巴细胞分泌细胞因子的不同将CD4+或CD8+分为介导细胞免疫的I型细胞和介导体液免疫的II型细胞.4.药物泵的功能检测

5.NK细胞的肿瘤杀伤活性检测6.血小板的粘附,聚集功能检测第七页，共二十三页，2022年，8月28日树突状细胞分析（DendriticCells,DC)DC是主要的抗原递呈细胞，同时又是重要的先天免疫细胞，还是具有免疫调控功能的一个细胞群，没有发现特异性的抗原标记DC研究的主要内容包括直接分析计数、体外诱导检测,一般分为两群－PDC,MDC当前DC检测的方法：1）Lin-,CD11c,CD123,同时可能表达CD80,CD86,CD83,DR等2）利用BDCA1,2,3,4对外周血或其它组织DC进行分析3）CD14+16/CD85/CD33,CD14+16/CD85/CD123第八页，共二十三页，2022年，8月28日T细胞分析相对计数－淋巴细胞亚群数量检查项目和意义疾病CD3CD4CD8CD4/CD8NK自身免疫病降低增高降低降低AIDS降低严重降低增高降低SARS降低降低降低降低降低慢性活动性肝炎、肝硬化降低正常或增高降低降低肿瘤降低降低增高降低降低第九页，共二十三页，2022年，8月28日CD4细胞绝对计数对AIDS病人的诊断、疗效和预后有重要的指导意义，一般认为CUTOFF值为200/ul.绝对计数是加入浓度已知的标准微球与标本一起测定，流式细胞仪控制软件在设置后能自动计算出浓度对任何细胞群体都可以进行绝对计数第十页，共二十三页，2022年，8月28日Th1Th2细胞因子分泌细胞测定根据产生的细胞因子的类型和生物学功能,人的ＣＤ4+Ｔ细胞可以分为Ｔｈ1、Ｔｈ2Ｔｈ1细胞产生ＩＬ2、ＩＬ12、ＩＦＮγ、ＴＮＦβ等细胞因子,主要参与细胞介导的免疫反应、迟发性过敏反应,并在清除病毒等细胞内致病因子方面起着重要作用Ｔｈ2细胞分泌ＩＬ4、ＩＬ5、ＩＬ6、ＩＬ10、ＩＬ13等细胞因子,主要促进体液免疫反应,中和胞外病原体相应地，CD8+T细胞也可以分为Tc1和Tc2Th1细胞：介导细胞免疫、细胞毒性T细胞的生长和活化、巨噬细胞的活化、介导迟发型过敏反应。其功能亢进将导致炎症慢性迁延，器官特异性自身免疫病，急性排异反应和接触性皮炎等的发病和免疫病理损伤。Th2细胞：介导体液免疫，促进B细胞的生长、活化和分化，是IgG1和IgE类抗体的转换因子，其功能亢进将导致特异性过敏反应，参与高IgE综合症和嗜酸性粒细胞增多症。第十一页，共二十三页，2022年，8月28日Th1Th2检测Tips一定要确定T细胞是否已经活化，细胞转运阻滞是否成功，胞膜打孔是否有效第十二页，共二十三页，2022年，8月28日一定要用胞浆内同型对照（特别是FITC标记时），以便分别部分弱表达的细胞因子。第十三页，共二十三页，2022年，8月28日TETRAMER抗原递呈细胞（APC）携带抗原片段通过与TCR复合物结合，在APC和T细胞的MHC相容和其它共刺激分子的相互作用下激活T细胞并产生细胞免疫效应。MHC-四聚体染色技术用于抗原特异性T细胞分析的原理在于体外模仿上述抗原递呈的过程来实现对特异性T细胞的鉴定，通过流式细胞仪这种高通量分析仪器对标本中这群细胞进行分析

四聚体技术的优势是：可以对特异性免疫细胞进行定量；用流式细胞仪检测可以快速测定大量细胞，可以同时进行其它表面染色，可以直接用外周血测定而不需要培养；四聚体染色不会杀伤细胞，因此染色后的细胞可以进行分选或其它功能分析；四聚体对所有的特异性T细胞都能够结合，而不仅仅是对有功能的细胞进行检测。不同厂家的MHC四聚体产品不太一样：贝克曼库尔特公司创造性地构建和表达了MHC分子α3链的区域突变的蛋白（iTAg），能降低其与非特异性T细胞结合，大大提高了特异性。并且将MHC四聚体直接标记荧光，和常用的抗原多肽负载后整体商品化，也有单独的MHC分子（iTAg）单独出售，极大方便了研究者第十四页，共二十三页，2022年，8月28日第十五页，共二十三页，2022年，8月28日CD4CD25Treg调控性T细胞的主要功能是抑制机体免疫功能，太强则免疫耐受，太弱会引起自身免疫反应调控性T细胞调节抗原递呈细胞对抗原的递呈调控性T细胞的表型是CD4+CD25bright，逐渐发现越来越多的其它分子可能能够更精确限定（eg.FOX-1?)CD25也是免疫细胞晚期活化的标记，但表达的平均荧光强度不足够强第十六页，共二十三页，2022年，8月28日非特异性的先天免疫细胞δＴ细胞:占外周血T细胞的10％以下，非抗原依赖型免疫细胞，在传染病、肿瘤病人外周血数量增加，表达CD3量较普通T细胞多NK细胞：占外周血淋巴细胞8－25％，传染病和肿瘤病人数量偏低。NK细胞可以根据NKR的不同而分类，丙型肝炎的发生和预后可能与NK细胞的表型相关DC：分布与淋巴组织和外周血，为非成熟状态，遇到相应的抗原后主要分泌IFN-alpha来发挥左右第十七页，共二十三页，2022年，8月28日其它重要分子的流式分析的意义粘附分子：物种间高度保守，与细胞间通讯，干细胞HOMING，肿瘤的发生可能有很重要的关系，如CD11C/CD18-CD54与DC成熟和迁移有关；CD209-CD102与抗原递呈有关CD26:移植后造血干细胞表达可能不利于该细胞的homing，有证据表明抑制造血干细胞有利用移植成功第十八页，共二十三页，2022年，8月28日流式细胞术在移植中的应用移植配型和群体反应性抗体的检测荧光示踪标记的移植细胞：CFSE是一个确定的荧光标记物，开发其它稳定的荧光素应该更有帮助第十九页，共二十三页，2022年，8月28日流式细胞仪分选为达到最高的分选效率，实用中最好先用磁珠分选系统进行初步分选活细胞分选非常有用第二十页，共二十三页，2022年，8月28日流式细胞术在生物医学研究的新方向细胞多态性分析：受体、抗原折叠、HLA等，包括CXCR4,CCR5,DC-SIGN(与AIDS易感性有关），NKR(中国科大研究领先项目）信号传导（实际主要为胞浆内磷酸化及去磷酸化蛋白的检测）新型荧光特异性探针：胞内病原体检测、转录因子检测、细胞器或细胞生命活动指标的新荧光素的应用利用分选的细胞进行体内和体外功能研究与其它定位性的荧光设备联合使用（如MPE,CONFOCAL,IC100等）第二十一页，共二十三页，2022年，8月28日CellLabIC100Completed