高效液相色谱培训教案

关于高效液相色谱培训教案第一页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四第一节高效液相色谱的特点

高效液相色谱法作为色谱分析法的一个分支，是在20世纪60年代末期，在经典液相色谱法和气相色谱法的基础上，发展起来的新型的分离分析技术。液相色谱包括传统的柱色谱、薄层色谱和纸色谱。20世纪50年代后气相色谱法在色谱理论研究和实验技术上迅速崛起，而液相色谱技术仍停留在经典操作方式，其操作繁琐，分析时间很长，因而未受到重视。20世纪60年代以后，随气相色谱法对高沸点有机物分析局限性的逐渐显现，人们又重新认识到液相色谱法可弥补气相色谱法的不足之处。因此，在20世纪60年代后，高效液相色谱技术才有了很快的发展。

第二页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四高效液相色谱（highperformanceliquidchromatography，HPLC）还可称为高压液相色谱（highpressureliquidchromatography）、高速液相色谱（highspeedliquidchromatography）、高分离度液相色谱（highresolutionliquidchromatography）或现代液相色谱（modernliquidchromatography）。

第三页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四1．1906年由俄国植物学家Tsweet创立

植物色素分离见图示

2、20世纪20年代，许多植物化学家开始采用色谱方法对植物提取物进行分离，色谱方法才被广泛的应用。3、30～40年代发表了薄层色谱、纸色谱的论文4、40年代瑞典科学家Tiselius等在分配液相色谱、吸附色谱和电泳领域取得了成果※5、50年代英国Martin和Synge建立GC色谱※6、60年代GC-MS联用分析已不能满足分析测试的要求

一、色谱法（chromatograph）的起源和发展第四页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四图示固定相——CaCO3颗粒流动相——石油醚

植物色素混合物第五页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四7、70年代HPLC崛起，气相色谱和高效液相色谱，逐步成为各行各业必不可少的分析工具，广泛应用于各个生产领域。8、1975年，美国Dow化学公司的H.Small等人首先提出的离子色谱的概念，在分离柱后加一个抑制柱，同年商品化的离子色谱仪问世。9、1979年，美国依阿华州立大学J.S.Fritz等人提出的非抑制型离子色谱仪。10、20世纪80年代以后，一种新型的色谱技术—毛细管电泳技术随之出现。11、20世纪90年代以后，ELSD一种新型的检测器出现，改变了弱紫外吸收物质的梯度检测难题。12、20世纪90年代中期以后，用于HPLC的MS检测器开始普及，使液相进入定性的时代。

第六页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四进入21世纪，HPLC在多个方面取得突破：Merck商品化的一体化柱，给人们一种全新的色谱柱概念。2004年，Waters提出了UPLC的新概念，超高压液相色谱。借助小颗粒的填料，特殊化的设计，实现超高效和快速、高通量的分析。2004年10月13日，ESA公司向外界宣布了一项高效液相色谱的最新技术突破，Corona™带电气溶胶检测器（CAD）诞生，新一代的通用型检测器。2005年，岛津发布了第一个基于Web的HPLC系统。HPLC向高通量、高灵敏、网络化、小型化发展。

第七页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四二、色谱法定义、分离基础和目的定义：利用各组分物理化学性质的不同，在流动相流 经固定相时，由于各组分在两相间的吸附、分 配或其它亲和力的差异而产生不同速度的移 动，最终达到分离的目的。图例分离基础：差速迁移

(例:赛跑)目的：多组分分离，实现定性定量分析第八页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四图示分离机制：各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离吸附→解吸→再吸附→再解吸→无数次洗脱→分开碳酸钙吸附剂石油醚流动相色素第九页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四三、高效液相色谱与其它色谱方法的比较1.HPLC与经典LC的比较从分析原理上讲，高效液相色谱法和经典液相（柱）色谱法没有本质的差别，但由于它采用了新型高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相，而使经典的液相色谱法焕发出新的活力。

第十页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四三、高效液相色谱与其它色谱方法的比较1.HPLC与经典LC的比较经典液相（柱）色谱法使用粗粒多孔固定相，装填在大口径、长玻璃柱管内，流动相仅靠重力流经色谱柱，溶质在固定相的传质、扩散速度缓慢，柱入口压力低，仅有低柱效，分析时间很长。高效液相色谱法使用全多孔微粒固定相，装填在小口径、短不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵进入高柱压的色谱柱，溶质在固定相的传质，扩散速度大大加快，从而在短的分析时间内获得高柱效和高分离能力。

第十一页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四三、高效液相色谱与其它色谱方法的比较1.HPLC与经典LC的比较见下表方法项目高效液相色谱法经典液相色谱法色谱柱：柱长/cm柱内径/mm10~252~1010~20010-~50固定相粒度：粒径/μm筛孔/目5~502500~30075~600200~30色谱柱入口压力/MPa2~200.001~0.1色谱柱柱效/（理论塔板数/m）2×103~5×1042~50进样量/g10-6~10-21~10分析时间/h0.05~1.01~20第十二页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四2.HPLC与GC的比较高效液相色谱法与气相色谱法有许多相似之处。气相色谱法具有选择性高、分离效率高、灵敏度高，分析速度快的特点，但它仅适于分析蒸汽压低、沸点低的样品，而不适于分析高沸点有机物、高分子和热稳定性差的化合物以及生物活性物质，因而使其应用受到限制。在全部有机化合物中仅有20%的样品适用于气相色谱分析。高效液相色谱法却恰可弥补气相色谱法的不足之处，可对80%的有机化合物进行分离和分析，此两种方法的比较如下：不同色谱方法适用的分子量范围方法缩写方法全称分子量范围能检测的有机化合物的比重GPC凝胶渗透色谱＞10380—85%HPLC高效液相色谱法400--2000GC气相色谱法10—40015—20%第十三页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四2.HPLC与GC的比较分析对象及范围流动相的选择操作条件GC能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，占有机物的20%流动相为有限的几种“惰性”气体，只起运载作用，对组分作用小加温常压操作HPLC溶解后能制成溶液的样品，高沸点、高分子量、难气化、离子型的稳定或不稳定化合物，占有机物的80%流动相为液体或各种液体的混合。它除了起运载作用外，还可通过溶剂来控制和改进分离。室温、高压下进行相同：均为高效、高速、高选择性的色谱方法，兼具分离和分析功能，均可以在线检测第十四页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四与经典液相色谱法相比

颗粒极细（一般为10m以下）、规则均匀的固定相，(键合相)传质阻抗小，柱效高，分离效率高；高压输液泵输送流动相，流速快，分析速度快；高灵敏度检测器，灵敏度大大提高。紫外检测器最小检测限可达109g，而荧光检测器最小检测限可达1012g。

四、高效液相色谱法的特点第十五页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四与气相色谱法相比不受试样的挥发性和热稳定性的限制，应用范围广；可选用各种溶剂作为流动相，对分离的选择性有很大作用，选择性高；一般在室温条件下进行分离，不需要高柱温。

第十六页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四优点：“三高”、“一快”、“一广”缺点：高选择性——可将性质相似的组分分开高效能——反复多次利用组分性质的差异产生很好分离效果高灵敏度——10-11~10-13g，适于痕量分析分析速度快——几~几十分钟完成分离一次可以测多种样品应用范围广——气体，液体、固体物质

对未知物分析的定性专属性差需要与其他分析方法联用(GC-MS,LC-MS)第十七页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四按分离机制分类：分配色谱法吸附色谱法离子交换色谱法空间排阻色谱法第二节HPLC分类第十八页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四基本类型色谱法的分离机制对于不同的分离机理，K的含义不同。吸附色谱

吸附系数

分配色谱

分配系数

离子交换色谱

离子交换系数

统称K

分子排阻色谱

分子排阻系数第十九页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四1.吸附色谱（液-固吸附色谱）：以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂。流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。2.分配色谱（液-液分配色谱）：早期通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定相,现多为化学键合固定相，即用化学反应的方法通过化学键将固定液结合在担体表面。第二十页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四

3.离子交换色谱：固定相为离子交换树脂，流动相为无机酸或无机碱的水溶液。各种离子根据它们与树脂上的交换基团的交换能力的不同而得到分离。4.空间排阻色谱（凝胶色谱）以凝胶为固定相。凝胶是一种经过交联的、具有立体网状结构和不同孔径的多聚体的通称。如葡聚糖凝胶、琼脂糖等软质凝胶；多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶；第二十一页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四（一）吸附色谱法要求：固定相→吸附剂（硅胶或AL2O3）具表面活性吸附中心分离机制：见图示吸附系数注：Ka与组分的性质、吸附剂的活性、流动相的性质及温度有关next吸附平衡Xm+nYa→Xa+nYm

第二十二页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四图示分离机制：各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离吸附→解吸→再吸附→再解吸→无数次洗脱→分开

back第二十三页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四（二）分配色谱法要求：固定相→机械吸附在惰性载体上的液体流动相→必须与固定相不为互溶载体→惰性，性质稳定，不与固定相和流动相发生化学反应分离机制见图示

分配系数注：K与组分的性质、流动相的性质、固定相的性质以及柱温有关next第二十四页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四图示分离机制利用组分在流动相和固定相间溶解度差别实现分离连续萃取过程back第二十五页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四分配色谱法分类正相分配色谱：流动相的极性弱于固定相的极性反相分配色谱：流动相的极性强于固定相的极性正相分配色谱：极性强的组分后被洗脱。 （库仑力和氢键力）反相分配色谱：极性强的组分先出柱。第二十六页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四（三）离子交换色谱法要求：固定相→离子交换树脂流动相→水为溶剂的缓冲溶液被分离组分→离子型的有机物或无机物分离机制见图示选择性系数

阳离子交换树脂

RSO3-H++X+→RSO3-X++H+

注：Ks与离子的电荷数、水合离子半径、流动相性质、离子交换树脂性质以及温度有关next

固定离子可交换离子待测离子第二十七页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四图示分离机制：

依据被测组分与离子交换剂交换能力（亲和力）不同而实现分离back第二十八页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四（四）空间排阻色谱法要求：固定相→多孔性凝胶流动相→水——凝胶过滤色谱流动相→有机溶剂——凝胶渗透色谱分离机制见图示渗透系数

注：Kp仅取决于待测分子尺寸和凝胶孔径大小，与流动相的性质无关next第二十九页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四图示分离机制：利用被测组分分子大小不同、在固定相上选择性渗透实现分离back第三十页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四结论：四种色谱的分离机制各不相同，分别形成吸附平衡、分配平衡、离子交换平衡和渗透平衡K分别为吸附系数，狭义分配系数，选择性系数和渗透系数除了凝胶色谱法中的K仅与待测分子大小尺寸、凝胶孔径大小有关外，其他三种K值都受组分的性质、流动相的性质、固定相的性质以及柱温的影响第三十一页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四按固定相的固定方式分：平面色谱

纸色谱薄层色谱高分子薄膜色谱柱色谱填充柱色谱毛细管柱色谱

第三十二页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四按溶质在色谱柱洗脱的动力学过程分类：洗脱法前沿法置换法第三十三页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四洗脱法（elutionmethod）又称淋洗法，将含有不同组分的样品注入色谱柱，流动相连续流过色谱柱，并携带样品组分在柱内向前移动，经色谱分离后，样品中不同组分依据与固定相和流动相相互作用的差别，而顺序流出色谱柱。前沿法（frontalmethod）又称迎头法，如将含三个等量组分的样品溶于流动相，组成混合物溶液，并连续注入色谱柱，由于溶质的不同组分与固定相的作用力不同，则与固定相作用最弱的第一个组分首先流出，其次是第二个组分与第一个组分混合流出，最后是与固定相作用最强的第三个组分与第二个组分和第一个组分混合一起流出。此法仅第一个组分的纯度较高，其他流出物皆为混合物，不能实现各个组分的完全分离。置换法（displacementmethod）又称顶替法，当含有三种组分的混合物样品注入色谱柱后，各组分皆与固定相有强作用力，若使用一般流动相无法将他们洗脱下来，为此可使用一种比样品组分与固定相间作用力更强的置换剂（或称顶替剂）作流动相，当他注入色谱柱后，可迫使滞留在柱上的各个组分，依其与固定相作用力的差别而依次洗脱下来，且各谱带皆为各个组分的纯品。第三十四页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四第三节高效液相色谱法的应用范围和局限性

一、应用范围

高效液相色谱法适于分析高沸点不易挥发的、受热不稳定易分解的、分子量大、不同极性的有机化合物；生物活性物质和多种天然产物；合成的和天然的高分子化合物等。涉及石油化工产品、食品、合成药物、生物化工产品及环境污染物等，约占全部有机化合物的80%。其余20%的有机化合物，包括永久性气体，易挥发低沸点及中等分子量的化合物，只能用气相色谱法进行分析。依据样品分子量和极性则要选择相应的HPLC分离方法。第三十五页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四极性增加不溶于水溶于水非极性离子非离子极性吸附反向分配分配正向分配离子交换尺寸排阻凝胶渗透凝胶过滤分子量化学、生物学和医学等应用广泛。如氨基酸、蛋白质、核酸、烃、碳水化合物、药品、多糖、高聚物、农药、抗生素、胆固醇、金属有机物等分析，大多(80%)是通过HPLC来完成的。应用各种HPLC方法的应用范围及对象第三十六页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四二、方法的局限性

高效液相色谱法虽具有应用范围广等的优点，但也有下述局限性：1、在高效液相色谱法中，使用多种溶剂作为流动相，当进行分析时所需成本高于气相色谱法，且易引起环境污染。当进行梯度洗脱操作时，它比气相色谱法的程序升温操作复杂。2、高效液相色谱法中缺少如气相色谱法中使用的通用型检测器（热导检测器和氢火焰离子化检测器）。3、高效液相色谱法不能替代气相色谱法，去完成要求柱效高达10万块理论塔板数以上，必须用毛细管气相色谱法分析组成复杂的具有多种沸程的石油产品。4、高效液相色谱法也不能代替中、低压柱色谱法，在200kPa至1MPa柱压下去分析受压易分解、变形的具有生物活性的生化样品。

第三十七页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四综上所述可知，高效液相色谱法也和任何一种常用的分析方法一样，都不可能十全十美，作为使用者在掌握了高效液相色谱法的特点，使用范围和局限性的前提下，充分利用高效液相色谱法的特点，就可在解决实际分析任务中发挥重要的作用。

第三十八页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四第二章高效液相色谱基本概念一、什么是高效液相色谱？二、色谱过程三、常用的基本术语第三十九页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四HighPerformanceLiquidChromatography，高效液相色谱法，简称：HPLC。是一种区别于经典液相色谱；基于仪器方法的高效能分离手段：高性能的色谱柱，高精度、耐高压的输液泵以及高灵敏度的检测器。广泛应用于各个领域：医药/环保/石化/生命科学/食品及农业……

在技术，理论及应用上仍处于发展阶段。

一、什么是高效液相色谱？第四十页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四二、色谱过程色谱过程：指物质分子（被分离组分）在相对运动的两相（流动相和固定相）中的“分配”平衡过程以吸附色谱为例见图示色谱过程：吸附→解吸→再吸附→再解吸→反复多次洗脱→被测组分分配系数不同→差速迁移→分离第四十一页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四图示吸附能力弱的组分先流出吸附能力强的组分后流出组分的结构和性质微小差异与固定相作用差异随流动相移动的速度不等差速迁移色谱分离。第四十二页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四三、常用的基本术语1、流出曲线和色谱峰2、基线、噪音和漂移3、峰宽——柱效参数4、峰高和峰面积——定量参数5、保留值——定性参数6、分配系数和容量因子——相平衡参数7、等温线8、分离因子和分离度——分离参数第四十三页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四1．流出曲线和色谱峰流出曲线（色谱图chromagtogram）：电信号强度随时间变化曲线色谱峰(peak)：流出曲线上突起部分第四十四页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四2．基线、噪音和漂移

baseline,noiseanddrift基线：仅有流动相通过检测器时产生的信号曲线。反映检测器噪音随时间变化的曲线

（稳定—平直直线）噪音：仪器本身所固有的，以噪音带表示（仪器越好，噪音越小）漂移：基线向某个方向稳定移动

（仪器未稳定造成）第四十五页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四3．峰宽peakwidth：色谱柱效参数峰宽W：色谱峰两侧拐点切线与基线相交的截距标准差σ：σ为正态分布曲线两拐点间距离的一半。对应0.607h处峰宽的一半注：σ↓小，峰↓窄，柱效↑高半峰宽W1/2：峰高一半处所对应的峰宽

注：除了用于衡量柱效，还可以计算峰面积第四十六页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四图示第四十七页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四峰高(peakheight；h)：组分在柱后出现浓度 极大时的检测信号，即色谱峰顶至基线的 距离。峰面积(peakarea；A)：色谱曲线与基线间 包围的面积。4．峰高和峰面积：色谱定量参数第四十八页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四5．保留值：色谱定性参数保留时间retentiontime,tR：从进样开始到组分出现浓度极大点时所需时间，即组分通过色谱柱所需要的时间死时间deadtime,t0：不被固定相滞留组分的保留时间，相当于流动相到达检测器所需要的时间调整保留时间tR’：组分由于和固定相作用，比不作用的组分在柱中多停留的时间，即组分在固定相中滞留的时间。等于组分的保留时间与死时间之差值表示组分在色谱固定相内滞留状态的参数（1）时间表示的保留值第四十九页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四图示第五十页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四续前保留体积VR：从进样开始到组分出现浓度极大点时所需要的流动相的体积。VR与tR和Fc（流动相流速mL/min）的关系

死体积V0：由进样器至检测器的流路中未被固定相占有的空间体积。包括从进样器到色谱柱导管的体积、固定相的孔隙及颗粒间隙、柱出口导管及检测器内腔体积的总和。（2）用体积表示的保留值第五十一页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四续前调整保留体积VR’：保留体积与死体积之差，即组分停留在固定相时所消耗流动相的体积第五十二页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四6．分配系数和容量因子：相平衡参数分配系数K（partitioncoefficient,平衡常数）：指在一定温度和压力下，组分在色谱柱中达分配平衡后，在固定相与流动相中的浓度比注：K为热力学常数与组分性质、固定相性质、流动相性质及温度有关实验条件固定，K仅与组分性质有关不同分离机理的色谱中，K名称虽有所不同，但物理意义都一样，表示平衡状态下两相中浓度之比第五十三页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四讨论：色谱条件一定时，tR主要取决K的大小（色谱法基本的定性参数）K↑，tR↑，组分后出柱K=0，组分不保留K→∞，组分完全保留分配系数K不容易获得，不常用tR（保留时间）与K（分配系数）的关系：第五十四页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四容量因子（capacityfactor,容量比，分配比）k：在平衡状态下，组分在固定相与流动相中的质量比★★第五十五页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四

色谱分离前提→各组分分配系数不等注：应选择合适分离条件使得难分离的组分K不等2）色谱条件（s，m，T）一定时，K一定→tR一定1）组分一定，K不等的前提s和m改变T改变第五十六页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四7、等温线：定义：指一定温度下，组分在两相中分配达平衡时，在两相中的浓度关系曲线，即cs对cm的关系曲线图示(1)线性等温线（理想）→对称峰(2)非线性等温线凸形→拖尾峰（常见）凹形→前沿峰固定相表面活性吸附中心未达饱和，K一定，与溶质浓度无关

固定相表面吸附中心活性不均，溶质分子先占据强吸附中心再占据弱吸附中心，K随着溶质浓度的增加而减小溶质与固定相作用，改变其表面性质，K随着溶质浓度的增加而增加第五十七页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四斜率=K线性：对称峰凹形：前沿峰凸形：拖尾峰第五十八页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四对称因子：（拖尾因子）正常峰（对称）非正常峰

前沿峰

拖尾峰色谱峰——fs在0.95~1.05之间——fs小于0.95——fs大于1.05

对称因子(symmetryfactor)——衡量色谱峰对称性第五十九页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四8.分离因子和分离度：—分离参数

描述相邻组分分离状态的指标（1）分离因子（分配系数比或选择性系数）定义：两种物质调整保留值之比分离因子α>1是色谱分离的必需条件第六十页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四（2）分离度（resolution,R）：衡量色谱分离条件优劣的参数定义：相临两组分间峰顶间距离是峰底宽平均值的几倍第六十一页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四讨论设色谱峰为正常峰，W1≈W2=4σ

第六十二页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四第三章HPLC仪器介绍第六十三页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四第六十四页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四第六十五页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四高压输液系统：储液罐、吸滤器、高压输液泵、脱气装置及梯度洗脱装置进样系统：进样器，进样阀分离系统：色谱柱，恒温箱检测系统：检测器数据处理和计算机控制系统：记录装置、色谱工作站第六十六页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四1、贮液器和吸滤器：一、高压输液系统贮液器:0.5-2L的玻璃瓶溶剂吸滤器:Ni合金，孔约0.45

m，防止颗粒物进入泵内。第六十七页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四流动相贮器俗称贮液瓶，它对大多数有机化合物呈化学惰性，耐酸碱腐蚀。常见质地为玻璃或塑料，容量约为0.5L～2.0L，通常无色透明，若流动相需避光，有棕色瓶供选择。贮液瓶放置位置要高于泵体，以便保持一定的输液静压差。使用过程贮液瓶应密闭，以防溶剂蒸发引起流动相组成的改变和防止空气中的O2、CO2重新溶解于已脱气的流动相中。第六十八页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四2、高压输液泵一、高压输液系统要求流量准确可调、可调范围宽：流动相流速在0.5-1.5mL/min，输液泵的最大流量5-10mL/min耐高压：输出压力常达30-60MPa液流稳定。结构材料应耐化学腐蚀第六十九页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四第七十页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四活塞型往复泵——液相色谱仪中使用最广泛的恒流泵第七十一页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四双活塞型往复泵第七十二页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四一、高压输液系统在线真空脱气装置3、脱气装置：将相对分子量小的气体从溶剂中除去第七十三页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四流动相在使用前必须进行脱气处理，目的是除去其中溶解的气体。在装入贮液瓶之前必须经过0.45μm或0.22μm滤膜过滤。在洗脱过程中如存在气泡会增加基线噪音，严重时使分析灵敏度降低。此外溶解在流动相中的氧气，会造成荧光猝灭，影响荧光检测器的检测，还可能导致样品中某些组分被氧化或使柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。常用的脱气方法有如下几种：第七十四页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四1．超声波振动脱气将欲脱气的流动相置放于超声波提取器中，用超声波振荡10～30min。此法较简单、常用。2．抽真空脱气用微型真空泵，降压至0.05～0.07Mpa既可除去溶解的气体，使用水泵连接抽滤瓶和G4微孔玻璃漏斗可以一起完成过滤机械杂质和脱气的双重任务。由于抽真空会引起混合溶剂组成的变化，故此法适用于单一溶剂的体系脱气。对于多元溶剂体系，每种溶剂应预先脱气后再进行混合，以保证混合后的比例不变。第七十五页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四3.加热回流脱气用于需要彻底脱气的流动相（电化学检测器），因为使用了回流冷凝器可减少挥发性组分的损失。此法的脱气效果较好，不提倡用于混合流动相。4.吹氦脱气使用在液体中比空气溶解度低的氦气在0.1Mpa压力下，以60mL/min的流速缓缓地通过流动相10～15min，赶去溶入的气体。此法适用于所有的溶剂，脱气效果较好，但价格较贵。5．真空在线脱气把真空脱气装置串接到贮液系统中，并结合膜过滤器，实现流动相在进入输液泵前的连续真空脱气。此法可适用于多元溶剂体系。第七十六页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四一、高压输液系统4、梯度洗脱装置：为什么要进行梯度洗脱？使保留值相差很大的多种成分在合理的时间内全部洗脱并达到相互分离梯度洗脱：在分离过程中逐渐改变流动相组成，如溶剂的极性、离子强度、pH值等。第七十七页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四一、高压输液系统高压梯度：用于二元梯度，用两个泵分别按设定的比例输送A和B两溶液至混合器

第七十八页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四一、高压输液系统低压梯度：只用一个高压泵，在泵前安装了一个比例阀，混合就在比例阀中完成。

第七十九页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四二、进样系统将样品溶液准确送入色谱柱的装置

——手动方式、自动方式密封性好、死体积小、重复性好、进样时引起色谱系统的压力和流量波动要很小。进样器要求常用手动进样器——六通阀进样器第八十页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四二、进样系统六通阀进样LoadInject第八十一页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四自动进样装置采用微处理机控制进样阀采样（通过阀针）、进样和清洗等操作。操作者只需把装好样品的小瓶按一定次序放入样品架上（有转盘式、排式），然后输入程序（如进样次数、分析周期等），启动，设备将自行运转。第八十二页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四三、色谱分离系统

色谱分离系统包括保护柱、色谱柱、恒温装置和连接阀等。分离系统性能的好坏是色谱分析的关键。1、保护柱

为保护分析柱挡住来源于样品和进样阀垫圈的微粒，常在进样器与分析柱之间装上保护柱。保护柱是一种消耗性柱，一般只有5cm左右长，在分析50～100个比较脏的样品之后需要换新的保护柱芯。保护柱用分析柱的同种填料填装，但粒径要大得多，便于装填。第八十三页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四三、色谱分离系统柱长15~30cm，内径4~5mm基质(硅胶或高分子聚合物微球)功能层(固定在基质表面对样品分子保留起实质作用的有机分子或功能团)2、色谱柱第八十四页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四常见色谱柱的类型专业的液相色谱仪厂家都有色谱柱生产，除此外还有很多专业的色谱柱厂家。C18—又称ODS柱，使用最普遍、规格多，适合大多数化合物的分析，市场上品种繁多，值得注意的是同样的C18柱，得到的结果可能非常不一致，尤其是极性或离子化合物。流动相为甲醇（乙腈）水系统。C8—类同于C18柱，保留能力比C18差。C4，C2，C1—反相，用于一些特定的化合物分析，寿命较短。NH2—既能用于反相又可用于正相，常用于小分子的糖分析。第八十五页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四色谱柱的保护1、在使用新柱之前，最好用有机溶剂在低流量下（0.2-0.3ml/min）冲洗30min，长时间未用的分析柱也要同样处理。2、定期使用有机溶剂冲洗柱子。3、使用缓冲盐时，要先用含5%-10%甲醇的水溶液冲洗，再用有机溶剂冲洗4、净化样品5、分离条件6、不使用时，要盖上盖子，避免固定相干涸第八十六页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四3、柱恒温箱柱温是液相色谱的重要参数，精确控制柱温可提高保留时间的重现性。一般情况下较高柱温能增加样品在流动相的溶解度，缩短分析时间，通常柱温升高6℃，组分保留时间减少约30%；升高柱温能增加柱效，提高分离效率；分析高分子化合物或粘度大的样品，柱温必须高于室温；对一些具有生物活性的生物分子分析时柱温应低于室温。液相色谱常用柱温范围一般为室温至60℃。第八十七页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四四、检测系统用来连续检测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置。溶质性检测器：仅对被分离组分理化特性响应紫外、荧光、电化学检测器总体检测器：对试样和洗脱液总理化性质响应示差折光，电导检测器第八十八页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四石英窗接色谱柱UV光电倍增管废液四、检测系统1、紫外检测器微量吸收池，光程为2-10mm,体积约为1~10L最小检测量10-9g·ml-1对流量和温度波动不敏感可用于梯度洗脱。

最常用的通用型检测器第八十九页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收优点：①灵敏度高②对温度和流速不敏感③可用于梯度洗脱缺点：仅适用于测定有紫外吸收的物质。第九十页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四四、检测系统光电二极管阵列检测器时间、光强度和波长三维谱第九十一页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四二极管阵列检测器的优点①采集三维谱图②峰纯度检验③光谱库检索④可以发现单波长检测时未检测到的峰第九十二页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四2、荧光检测器四、检测系统灵敏度高选择性好样品量很小适合药物和生化样品分析第九十三页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四原理：基于被分析组分发射的荧光强度进行检测优点：①灵敏度高，是最灵敏的检测器之一②选择性好③对温度和流速不敏感，可用于梯度洗脱缺点：仅适用于测定可产生荧光的物质可检测物质：多环芳烃、霉菌毒素、酪氨酸、色氨酸、儿茶酚氨等（具有对称共轭体系）第九十四页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四3、蒸发光散射检测器四、检测系统适于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品的检测通用型和质量型检测器第九十五页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四原理：流出物在检测器中被高速氮气喷成雾状液滴，溶剂挥发后，溶质形成微小颗粒，被载气带到检测系统，进入散射室中，检测散射光的强度。优点：消除了溶剂干扰以及温度变化带来的基线漂移，可梯度洗脱，灵敏度高，是HPLC的通用型检测器。缺点：不能使用不挥发性盐做流动相，如磷酸盐第九十六页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四光源调零光学零参比样品平面镜透镜光电转换记录仪放大器遮光板溶剂相和样品+溶剂相对光的折射率不同，造成两束光强度差变化，差示信号放大记录代表样品浓度通用型检测器，灵敏度为10-7g/ml对温度变化敏感，且不适于梯度淋洗4、示差折光检测器四、检测系统第九十七页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四原理：连续测定流通池中溶液折射率来测定试样中各组分浓度。优点：通用型检测器缺点：①对温度变化敏感②对溶剂组成变化敏感，不能用于梯度检测③属于中等灵敏度的检测器第九十八页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四检测器梯度

主要特点紫外-可见光可对流速和温度变化敏感；池体积可制作得很小；对溶质的响应变化大。荧光可选择性和灵敏度高；易受背景荧光、消光、温度、pH和溶剂的影响。化学发光困难灵敏度高；发光试剂受限；受流动相和脉动的影响。电导不可是离子性物质的通用检测器；受温度和流速影响；不能用于有机溶剂体系。电化学困难选择性高；受流动相pH值和杂质的影响；稳定性差。蒸发光散射可可检测所有物质。示差折光不可检测所有物质；不适合微量分析；对温度变化敏感质谱可主要用于定性和半定量。原子吸收光谱可选择性高。ICP发射光谱可可进行多元素同时检测。火焰离子化可柱外峰展宽。第九十九页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四五、数据处理和计算机控制系统色谱工作站在线显示自动采集处理储存自动控制第一百页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四第四章高效液相色谱方法第一节HPLC的固定相和流动相

第二节HPLC方法及原理第一百零一页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四1、要求：粒径小、颗粒分布均匀传质快、渗透压小机械强度高、能耐高压化学稳定性好第一节HPLC的固定相和流动相

一、固定相第一百零二页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四一、固定相（1）按承受压力分刚性固体：硅胶为基质

主要用于吸附、分配和键合色谱硬胶：以聚合物为基质主要用于离子交换和尺寸排阻色谱2、固定相载体第一百零三页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四（2）按孔隙深度分表面多孔型：实心玻璃珠为基体，基体表面覆盖一层多孔活性材料适于常规分离分析全多孔型：全部由硅胶或氧化铝微粒聚集而成适于复杂混合物的分离。一、固定相2、固定相载体第一百零四页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四3.常用固定相液固色谱固定相常用粒径3~10μm，理论塔板数过5万/米无定形全多孔硅胶：YWG球形全多孔硅胶：YQG高分子多孔微球：YSG一、固定相第一百零五页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四3.常用固定相化学键合固定相以硅胶为载体，借化学反应方法将有机分子以共价键连接在硅醇基上一、固定相第一百零六页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四Si-O-R：热不稳定、易水解，适于不含水或醇的流动相Si-R(或Si-N)：不水解，热稳定性较好。使用水溶液作流动相时，其pH应在4-8之间。Si-O-Si-R：不水解，热稳定性好，pH2-8范围内对水稳定3.常用固定相化学键合固定相一、固定相第一百零七页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四3.常用固定相化学键合固定相非极性键合相：十八烷基键合相（ODS，C18）中等极性键合相：醚基键合相极性键合相：氨基、氰基键合相一、固定相第一百零八页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四3.常用固定相其它固定相离子交换固定相：离子交换树脂、键合型离子交换树脂空间排阻色谱固定相：凝胶手性固定相：手性官能团键合或天然手性物质固着在载体上如环糊精亲合色谱固定相：生物专一性配基+载体一、固定相第一百零九页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四二、流动相——淋洗液，洗脱剂对样品有适宜溶解度，k=2~5；溶剂要与检测器匹配。高纯度、化学稳定性好适宜的粘度。过高柱压增加；过低易产生气泡1、流动相要求常用的低粘度溶剂：甲醇、乙腈等粘度过低的溶剂：戊烷、乙醚等第一百一十页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四2、流动相组成按组成不同：单组分和多组分；按极性：极性、弱极性、非极性；按使用方式：固定组成淋洗和梯度淋洗。二元或多元组合溶剂可灵活调节流动相极性常用溶剂:烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、甲醇、水。二、流动相——淋洗液，洗脱剂第一百一十一页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四正相色谱：极性固定相——非极性流动相（加极性调节剂如氯仿）——极性柱（正相柱）三、固定相和流动相的选择

反相色谱：非极性键合固定相（ODS）——极性流动相——非极性柱（反相柱）组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。流动相可选水或一定pH缓冲液，加甲醇或乙腈调节极性）第一百一十二页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四正相色谱低极性流动相反相色谱高极性流动相中等极性流动相中等极性流动相时间时间时间时间待测物极性：A>B>C正、反相色谱中极性和保留时间的关系第一百一十三页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四HPLC方法按流动相和固定相特征分为正相色谱、反相色谱按分离目的分为分析型、制备型按分离机理分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、空间排阻色谱等。第一百一十四页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四第二节HPLC方法及原理

一、液-液分配色谱法（LLPC）二、化学键合相色谱法（CBPC）三、液-固吸附色谱法(LSAC)四、离子交换色谱法（IEC）五、尺寸排阻色谱法（SEC）第一百一十五页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四一、液-液分配色谱法（LLPC）

1.固定相强极性固定液：β，β′一氧二丙睛中等极性固定液：聚乙二醇非极性固定液：角鲨烷

要求：流动相不与固定相互溶，流动相与固定相极性差别显著——避免固定液流失2.流动相第一百一十六页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四

一、液-液分配色谱法（LLPC）适于各种极性化合物的分离4.用途根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数。

3.分离原理缺点：固定液机械涂渍、固定液易流失第一百一十七页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四1、反相键合相色谱法（RPBPC）固定相：采用极性较小的键合固定相，如硅胶-C18H37（ODS，C18）、硅胶-苯基等二、化学键合相色谱法（CBPC）流动相：

采用极性较强的溶剂，如甲醇、乙睛-水、水和无机盐的缓冲溶液等。第一百一十八页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四分离机理——疏溶剂作用理论非极性的烷基键合相——硅胶表面的十八烷基“分子毛”——较强的疏水特性。二、化学键合相色谱法（CBPC）1、反相键合相色谱法（RPBPC）第一百一十九页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四分子中非极性部分——疏水烷基

——缔合作用，分子保留分子极性部分——极性流动相

——离开固定相，减小保留两种作用力之差，决定分子在色谱中的保留行为流动相——极性溶剂分离物——极性官能团有机物第一百二十页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四改变流动相配比可分离极性化合物用水和无机盐的缓冲液为流动相可分离易离解的样品有机酸、有机碱等。用途

1、反相键合相色谱法（RPBPC）主要用于分离非极性至中等极性的各类有机化合物二、化学键合相色谱法（CBPC）第一百二十一页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四固定相：极性的有机基团，CN、NH2。双羟基等键合在硅胶表面流动相：非极性或极性小的溶剂（如正已烷）中加入适量极性溶剂（如氯仿、醇等）

分离机理：范德华力、诱导力或氢键力用途：多用于分离极性或中等极性化合物2、正相键合相色谱法（NPBPC）二、化学键合相色谱法（CBPC）第一百二十二页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四3、离子键合相色谱法

固定相：硅胶为基质，键合各种离子交换基团，如一SO3H、一CH2NH2、－C00H流动相：一般采用缓冲溶液。二、化学键合相色谱法（CBPC）分离原理：与离子交换色谱类同用途：多用于分离离子型化合物如酸、无机阴阳离子、氨基酸等第一百二十三页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四分离原理：物质在固定相上的吸附作用不同三、液-固吸附色谱法(LSAC)固定相：吸附活性强弱不等的吸附剂

硅胶、氧化铝、聚酸胶等。流动相：各种极性的洗脱剂用途：非极性溶剂中、具有中等相对分子质量且为非离子型的试样。特别适用于分离异构体第一百二十四页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四原理：不同待测离子对固定相亲和力的差别固定相：基质：合成树脂（聚苯乙烯）、纤维素和硅胶表面键合离子：阳离子和阴离子交换树脂四、离子交换色谱法（IEC）流动相：一定pH和盐浓度的缓冲溶液用途：适用无机离子、有机离子混合物的分离例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。第一百二十五页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四固定相：

化学惰性的多孔性材料，如聚苯乙烯凝胶、亲水凝胶、无机多孔材料。流动相：

作用不是为了控制分离，而是为了溶解样品或减小流动相粘度。五、尺寸排阻色谱法（SEC）常用流动相——四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水原理：利用被测组分分子大小不同、在固定相上选择性渗透实现分离。第一百二十六页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四凝胶过滤色谱：以水或缓冲液作流动相主要适合于水溶性高分子的分离凝胶渗透色谱：以有机溶剂作流动相主要适合于脂溶性高分子的分离用途五、尺寸排阻色谱法（SEC）特点：固定相与分子间作用力趋于零，柱寿命长相对分子质量差别必须大于10％才能分离第一百二十七页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四第五章HPLC的建立与应用一、建立HPLC分析方法的一般步骤

1、根据被分析样品的特性选择适用于样品分析的一种HPLC分离方式。材料来源、浓度范围组分特性、结构、分子量、溶解性等第一百二十八页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四

一、建立HPLC分析方法的一般步骤

第一百二十九页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四一、建立HPLC分析方法的一般步骤

2、选择合适的分析方法适用的色谱柱：柱的规格（柱内径及柱长）和选用固定相（粒径及孔径）流动相检测器样品预处理第一百三十页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四一、建立HPLC分析方法的一般步骤

3.分析条件的优化流动相种类与配比梯度温度流速检测波长进样量第一百三十一页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四一、建立HPLC分析方法的一般步骤

4、由获得的色谱图进行定性分析和定量分析。第一百三十二页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四二、HPLC定性定量分析方法1、定性分析（1）色谱鉴定法：保留时间对照各物质在一定色谱条件下均有确定不变的保留时间，因此保留时间可作为定性指标。第一百三十三页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四应用范围：适用于简单混合物，对该样品已有了解并具有纯物质的情况。优点：应用简便，不需要其它仪器。缺点：定性结果的可信度不高。第一百三十四页，共一百五十三页，编辑于2023年，星期四（2）与其他仪器或化学方法联合定性混合物经色谱分析后，将各组分直接由接口导入其它仪器中进行定性。常用的联用方法