发酵分析高效液相色谱技术

高效液相色谱法它是在经典液相色谱实验基础上，引入气相色谱的理论。以液体作为流动相的色谱法。在技术上采用高压输液泵，高效固定相和高灵敏的检测器，而发展起来的快速分离分析技术。当前1页，总共92页。HPLC和经典液相色谱法的比较

高效液相色谱法经典液相色谱法色谱柱柱长/cm10～2510～200色谱柱柱内径/mm2～10（不锈钢管）10～50（玻璃管）固定相粒度（粒径μm）3～5075～600流动相流动方式高压输液泵压入靠重力流入溶液的传质、扩散速度快缓慢色谱柱入口压力/MPa2～200.001～0.1色谱柱柱效/（理论塔板数/m）2*103～5*1042～50进样量/（g）10-6～10-21～10分析时间/h0.05～1.01～20当前2页，总共92页。HPLCvsGC分析对象流动相工作条件气相色谱法气体和沸点较低的化合物，仅占有机物总数的20％

惰性气体温度较高高效液相色谱法高极性、高分子量、离子型的物质，占有机物总数近80％

液体可在室温下工作当前3页，总共92页。

特点：高压、高效、高速、高灵敏高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。LC＜＞GC互补性当前4页，总共92页。高效液相色谱法的特点（1）分离效能高：柱效可达5000~30000块/米（2）选择性高：通过流动相的控制来改善分离过程的选择性（3）检测灵敏度高：UV—最小检出量可以达到10-9g

FD--最小检出量可以达到10-12g（4）分析速度快:采用了高压泵当前5页，总共92页。HPLC液-固吸附液-液分配正相色谱反相色谱一般反相色谱离子对色谱离子抑制色谱离子交换色谱一般离子交换色谱离子色谱氨基酸分析空间排斥色谱凝胶渗透色谱凝胶过滤色谱假相色谱胶束色谱环糊精色谱亲合色谱，手性色谱，毛细管电泳当前6页，总共92页。结构流程高效液相色谱仪当前7页，总共92页。高压输液系统：储液罐、吸滤器、高压输液泵、脱气装置及梯度洗脱装置进样系统：进样器，进样阀分离系统：色谱柱，恒温箱检测系统：检测器记录系统：记录装置、色谱工作站当前8页，总共92页。色谱柱进样阀流动相检测器高压泵脱气装置当前9页，总共92页。1、流动相和储液罐（1）储液罐

材质：玻璃、不锈钢、氟塑料或特种塑料聚醚醚酮（PEEK）

棕色玻璃瓶会避免藻类的生长

容积：0.5~2.0L

放置位置：高于泵体，保持一定的输液静压差

注意：密封、过滤

一、高压输液系统当前10页，总共92页。液相色谱的流动相1.流动相特性（1）流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况。（2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，正相，极性柱也称正相柱。（3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液相色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。当前11页，总共92页。正相色谱反相色谱时间时间时间正、反相色谱中极性和保留时间的关系待测物极性：A>B>C当前12页，总共92页。2.流动相类别

按流动相组成分：单组分和多组分；按极性分：极性、弱极性、非极性；按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。当前13页，总共92页。3.流动相选择

在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。

常用溶剂的极性顺序：

水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六环>四氢呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>异丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>环己烷>己烷>煤油(最小)当前14页，总共92页。避免使用对不锈钢有腐蚀性的溶剂。例：硝酸、硫酸、盐酸、卤化物，四氯化碳与异丙醇或四氢呋喃的混合物，含强络合剂的溶液等。过滤——用滤膜过滤或垂熔漏斗过滤脱气——采用超声或过滤的方法注意流动相使用前冲洗使用含酸、碱、缓冲液的流动相后，必须用不含盐的有机溶剂-水冲洗！当前15页，总共92页。（2）流动相----过滤流动相过滤的目的

过滤去除可能存在的微小固体颗粒

保护色谱高压泵和色谱柱流动相过滤方法

在线溶剂过滤抽真空过滤当前16页，总共92页。溶剂吸滤器:Ni合金，孔约0.45

m，防止颗粒物进行泵内。当前17页，总共92页。流动相在线过滤：

清洁方法：1、用水冲洗残留溶剂后，将过滤器放在约35％浓硝酸里浸一小时2、用二次蒸馏水彻底冲洗过滤器3、将过滤器重新装好。4、定期清洗溶剂过滤器及溶剂瓶（每1～3个月至少清洗一次）不能用超声波清洗当前18页，总共92页。流动相抽真空过滤过滤用膜：水系和有机，孔径：0.22µm和0.45µm当前19页，总共92页。流动相脱气的目的使色谱泵的输液准确输液均匀准确，并且脉动减小保留时间及色谱峰面积的重现性提高提高检测的性能防止气泡引起的尖峰基线稳定，信噪比增加溶剂的紫外吸收本底降低保护色谱柱减少死体积防止填料的氧化（2）流动相----脱气当前20页，总共92页。常用的脱气方法有：抽真空脱气法：特点：可以一次完成过滤和脱气任务注意：抽真空会引起混合溶剂组分的变化，适合单一溶剂体系超声波脱气法简单，但效果不理想当前21页，总共92页。使用新鲜配制的流动相，特别是水溶剂或盐缓冲液建议不超过两天，最好每天更换流动相：water/methanol/trifluoroaceticacid(50/50/0.1)a:freshb:afterthreehoursc:aftereighthours当前22页，总共92页。主要部件之一，压力：150～350×105Pa。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性2、高压泵当前23页，总共92页。活塞型往复泵——液相色谱仪中使用最广泛的恒流泵当前24页，总共92页。当前25页，总共92页。当前26页，总共92页。当前27页，总共92页。双柱塞往复式串联泵示意图当前28页，总共92页。3、梯度洗脱装置：为什么要进行梯度洗脱？使保留值相差很大的多种成分在合理的时间内全部洗脱并达到相互分离梯度洗脱：在分离过程中逐渐改变流动相组成，如溶剂的极性、离子强度、pH值等。当前29页，总共92页。梯度洗脱装置

梯度洗脱技术可以提高柱效、缩短分析时间，改善检测器的灵敏度，它类似于GC种使用的程序升温技术

影响梯度洗脱的主要因素有：溶剂的纯度、溶剂的互溶性、检测器的种类

当前30页，总共92页。高压梯度：用于二元梯度，用两个泵分别按设定的比例输送A和B两溶液至混合器

当前31页，总共92页。低压梯度：只用一个高压泵，在泵前安装了一个比例阀，混合就在比例阀中完成。

当前32页，总共92页。四元低压梯度系统当前33页，总共92页。四元高压梯度系统当前34页，总共92页。泵压力不正常的主要原因：

气泡，主动阀故障，出口阀故障，密封垫或柱塞杆磨损，渗漏或堵塞，比例阀故障，传感器故障，使用比例阀混合时盐浓度太高

当前35页，总共92页。二、进样装置六通阀进样装置当前36页，总共92页。当前37页，总共92页。六通阀进样装置正面当前38页，总共92页。一定不能使用尖针！它会严重刮坏转子垫圈进样针当前39页，总共92页。六通阀进样装置反面连接当前40页，总共92页。自动进样器样品瓶置于进样针下方当前41页，总共92页。进样针穿过垫圈进入瓶中当前42页，总共92页。注射器抽取所设定的样品体积当前43页，总共92页。进样针收回当前44页，总共92页。转入针端口使之并成为流路的一部分当前45页，总共92页。进样注意点进样阀的废液出口端高度必须与进样针在同一水平位置，以免虹吸作用，使样品向针筒方向回流，或从废液口流出。使用前后，要用流动相（不含酸碱等缓冲液）或甲醇或水冲洗针孔，用针孔清洗器）。当前46页，总共92页。进样方法整个定量圈体积进样——为获得好的精密度，进样量应大于定量圈量的2-5倍以上。由于层流影响，需要有过量的样品液来取代管壁上的流动相。SampleMobilephase当前47页，总共92页。例20l定量圈，进样体积不能超过10l。否则，部分样品将会从出口流失。这是因为由于层流的关系，样品流经管中心的速度是平均速度的两倍。进样前应用流动相冲洗进样孔，以除去前一针留下的样品。注射针必须清洗干净。部分定量圈体积进样——当样品量少时，采用部分体积进样，进样量由微量注射器手动控制，要求：不得超过定量圈体积的1/2量当前48页，总共92页。三、分离系统-色谱柱柱材料和规格﹠不锈钢管﹠柱管的内径：0.5～4.6mm﹠填料粒度：3～10μm﹠柱长度：10～25

cm常用色谱柱有：ODS柱、氰基柱、氨基柱等当前49页，总共92页。色谱柱使用注意点：pH范围2-11.5。使用有机缓冲液，浓度以10-50mM为好。在中高pH下避免使用磷酸盐，碳酸盐缓冲液，最高操作温度60℃，最佳温度﹤40℃。分离碱性物质，所用流动相pH值应高于被测物pKa一个单位。当前50页，总共92页。柱pH范围最高温度

SBC18

90℃C860℃C360℃苯基60℃腈基60℃XDB60℃Extend-C1860℃123456789101112ZORBAXRP-HPLC系列柱的使用条件当前51页，总共92页。保存色谱柱时用100%甲醇或乙腈，柱两端必须用接头密封。停用数天后最使用时，应先用低流速甲醇冲洗1h左右，然后再换上流动相，否则直接用流动相，柱效会下降，峰形不好。新柱使用前应用甲醇或乙腈冲洗（0.5ml/min）。当前52页，总共92页。1、要求：粒径小、颗粒分布均匀传质快、渗透压小机械强度高、能耐高压化学稳定性好HPLC的固定相当前53页，总共92页。液-固吸附分离固定相种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等。结构类型：全多孔型和薄壳型；粒度：5～10μm。

当前54页，总共92页。

2.液-液分配及离子对分离固定相（1）全多孔型担体

氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见。现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料。（2）表面多孔型担体

（薄壳型微珠担体）

30～40μm的玻璃微球，表面附着一层厚度为1～2μm的多孔硅胶。当前55页，总共92页。（3）化学键合固定相

化学键合固定相：以硅胶为载体，借化学反应方法将有机分子以共价键连接在硅醇基上a.硅氧碳键型：≡Si—O—C

b.硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si—C

稳定，耐水，耐光，耐有机溶剂，应用最广。c.硅碳键型：≡Si—C当前56页，总共92页。化学键合固定相的特点：（1）传质快，表面无深凹陷。（2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；耐水，耐光，耐有机溶剂，稳定。（4）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性。（5）有利于梯度洗脱。当前57页，总共92页。化学键合固定相非极性键合相：十八烷基键合相（ODS，C18）中等极性键合相：醚基键合相极性键合相：氨基、氰基键合相当前58页，总共92页。反相键合相色谱法（RPBPC）固定相：采用极性较小的键合固定相，如硅胶-C18H37（ODS，C18）、硅胶-苯基等流动相：

采用极性较强的溶剂，如甲醇、乙睛-水、水和无机盐的缓冲溶液等。当前59页，总共92页。分离机理——疏溶剂作用理论非极性的烷基键合相——硅胶表面的十八烷基“分子毛”——较强的疏水特性。当前60页，总共92页。分子中非极性部分——疏水烷基——缔合作用，分子保留分子极性部分——极性流动相——离开固定相，减小保留两种作用力之差，决定分子在色谱中的保留行为流动相——极性溶剂分离物——极性官能团有机物当前61页，总共92页。改变流动相配比可分离极性化合物用水和无机盐的缓冲液为流动相可分离易离解的样品有机酸、有机碱等。主要用于分离非极性至中等极性的各类有机化合物

用途

当前62页，总共92页。固定相：极性的有机基团，CN、NH2。双羟基等键合在硅胶表面流动相：非极性或极性小的溶剂（如正已烷）中加入适量极性溶剂（如氯仿、醇等）分离机理：范德华力、诱导力或氢键力用途：多用于分离极性或中等极性化合物正相键合相色谱法（NPBPC）当前63页，总共92页。其它固定相离子交换固定相：离子交换树脂、键合型离子交换树脂空间排阻色谱固定相：凝胶手性固定相：手性官能团键合或天然手性物质固着在载体上如环糊精亲合色谱固定相：生物专一性配基+载体当前64页，总共92页。5、检测器主要作用：监测经色谱柱分离后的组分浓度变化，并由工作站记录数据，定性、定量分析。

当前65页，总共92页。

紫外检测器示差折光检测器

荧光检测器光电二极管阵列检测器当前66页，总共92页。

a.紫外检测器基于被分析组分对特定波长紫外光或可见光的选择性吸收，应用最广，对大部分有机化合物有响应。

灵敏度高；线性范围宽；流通池可做得很小(1mm×10mm，容积8μL)；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。当前67页，总共92页。紫外-可见光检测器光路示意图当前68页，总共92页。可变波长紫外检测器﹠

选用氘灯作为光源，在190—600nm范围内可连续调节，选择不同的波长检测当前69页，总共92页。b.光电二极管阵列检测器（DAD）

紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图。当前70页，总共92页。当前71页，总共92页。DAD检测器的主要特点

①可以同时得到多个波长的色谱图，可以计算不同波长处的相对吸收比②可以在色谱分离同时，对色谱峰的指定位置实时记录吸收光谱图，并得到最大吸收波长③在色谱运行期间，可以逐点进行光谱扫描，得到时间—波长—吸收值为坐标的三维图形当前72页，总共92页。当前73页，总共92页。三维：光谱-色谱图当前74页，总共92页。c.示差折光检测器

（Differentialrefractiveindexdetector）

除紫外检测器之外应用最多的检测器。可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度成正比。

通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）。灵敏度低，对温度敏感，不能用于梯度洗脱。

当前75页，总共92页。光源调零光学零参比样品平面镜透镜光电转换记录仪放大器遮光板溶剂相和样品+溶剂相对光的折射率不同，造成两束光强度差变化，差示信号放大记录代表样品浓度通用型检测器，灵敏度为10-7g/ml对温度变化敏感，且不适于梯度淋洗当前76页，总共92页。d.荧光检测器

（Fluorescencedetector）高灵敏度，高选择性。对多环芳烃，维生素B，黄曲霉素，卟啉类化合物，农药，药物，氨基酸，甾类化合物等有响应。当前77页，总共92页。检测器梯度

主要特点紫外-可见光可对流速和温度变化敏感；池体积可制作得很小；对溶质的响应变化大。荧光可选择性和灵敏度高；易受背景荧光、消光、温度、pH和溶剂的影响。化学发光困难灵敏度高；发光试剂受限；受流动相和脉动的影响。电导不可是离子性物质的通用检测器；受温度和流速影响；不能用于有机溶剂体系。电化学困难选择性高；受流动相pH值和杂质的影响；稳定性差。蒸发光散射可可检测所有物质。示差折光不可检测所有物质；不适合微量分析；对温度变化敏感质谱可主要用于定性和半定量。原子吸收光谱可选择性高。ICP发射光谱可可进行多元素同时检测。火焰离子化可柱外峰展宽。当前78页，总共92页。数据处理和计算机控制系统色谱工作站在线显示自动采集处理储存自动控制当前79页，总共92页。HPLC的建立与应用一、建立HPLC分析方法的一般步骤

1、根据被分析样品的特性选择适用于样品分析的一种HPLC分离方式。材料来源、浓度范围组分特性、结构、分子量、溶解性等当前80页，总共92页。

当前81页，总共92页。2、选择合适的分析方法适用的色谱柱：柱的规格（柱内径及柱长）和选用固定相（粒径及孔径）流动相检测器样品预处理当前82页，总共92页。3.分析条件的优化流动相种类与配比梯度温度流速检测波长进样量当前83页，总共92页。4、由获得的色谱图进行定性分析和定量分析。当前84页，总共92页