食品中铜绿假单胞菌检测

关于食品中铜绿假单胞菌检测第一页，共三十四页，编辑于2023年，星期四一、概述铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）俗称绿脓杆菌，因为在代谢过程中产生水溶性的绿色色素，使伤口与创面呈绿色，故名绿脓杆菌。

铜绿假单胞菌能在许多污染物质中存活并繁殖，生长营养需求不高，善于利用各种碳源和氨化合物作为氮源，在水、土壤、食品以及医院等环境广泛存在，甚至在蒸馏水、消毒液也不例外，如季铵类消毒液，特别是含有一些有机物的液体。

第二页，共三十四页，编辑于2023年，星期四铜绿假单胞菌可由多种途径传播，但主要是通过污染医疗器械、用具及带菌医护人员引起医源性感染，因此，对烧伤病房、手术器械及治疗器械应进行严格消毒灭菌，以保证无铜绿假单胞菌的污染。对铜绿假单胞菌感染的治疗，可应用庆大霉素、多粘菌素B和羧苄青霉素。铜绿假单胞菌抵抗力较其他革兰阴性菌强，56℃1h可杀灭，对很多抗生素具有耐受性。对消毒剂、干燥、紫外线等理化因素及不良环境抵抗力强，对化学药物的抵抗力比一般革兰氏阴性菌强大。第三页，共三十四页，编辑于2023年，星期四二、生物学特性1.培养特性本菌属于假单胞菌属，是一种非发酵革兰阴性无芽孢杆菌，菌体细长且长短不一，有时呈球杆状或线状，成对或短链状排列。菌体的一端有单鞭毛，在暗视野显微镜或相差显微镜下观察可见细菌运动活泼。2．菌体形态无芽孢，无夹膜，革兰阴性杆菌，有单鞭毛或丛鞭毛，运动活泼。菌体的大小为0.5～1µm×1.5～3.0µm，菌体笔直或弯曲。第四页，共三十四页，编辑于2023年，星期四3、生化特性氧化酶和过氧化氢酶阳性。O/F试验为氧化型，还原硝酸盐为亚硝酸盐，分解乙酰胺产生氨。98％菌株产生水溶性荧光色素。铜绿假单胞菌能液化明胶，酪蛋白水解，但淀粉不水解。90％以上的菌株产生蓝绿色色素。分解蛋白质能力强，发酵糖类能力较低，氧化分解葡萄糖，产酸不产气，不分解甘露醇、乳糖及蔗糖，能液化明胶，分解尿素，不形吲哚，氧化酶试验阳性，还原硝酸盐产气，靛基质阴性，不产硫化氢。第五页，共三十四页，编辑于2023年，星期四三、致病性•主要致病物质是内毒素，此外尚有菌毛、荚膜、胞外酶和外毒素等多种致病因子。可引起局部化脓性炎症，也可引起中耳炎、角膜炎、尿道炎、胃肠炎、心内膜炎、脓胸，还可引起菌血症、败血症及引起婴儿严重的流行性腹泻。•WHO的HACCP评估明确指出铜绿假单胞菌是婴儿瓶装饮用水的危害指示菌，可造成婴儿腹泻。尤其是抵抗力较差的老弱病幼孕人群，饮用含铜绿假单胞菌的瓶装水很可能导致疾病的发生，患者食入103~104个菌体细胞即可被侵害。铜绿假单胞菌的生长还将增加亚硝酸盐的含量-参考文献。第六页，共三十四页，编辑于2023年，星期四

国内外污染情况-参考文献•国内污染情况：-瓶装天然矿泉水铜绿假单胞菌的检出率1.2％～23.6％；-瓶装饮用纯净水铜绿假单胞菌的检出率11.6％。•国外污染情况：-Richards等在104件检品中的4件分离到铜绿假单胞菌；-Rosenberg报告德国1.2％～10.2％的瓶装矿泉水检出铜绿假单胞菌。•刚出厂的产品中铜绿假单胞菌数量较少，但有文献报道5加仑桶装产品（15～31天的保存期），铜绿假单胞菌可生长繁殖达到CFU/ml。•国内卫生标准：0CFU/250ml第七页，共三十四页，编辑于2023年，星期四三、实验室检验

GB/T8538-2008

铜绿假单胞菌检测（滤膜法）第八页，共三十四页，编辑于2023年，星期四原理

将250mL水样用孔径为0.45μm的滤膜过滤，并将滤膜移至CN琼脂培养基上，于36℃士1℃恒温箱中培养48h，能够在CN琼脂上生长并产生绿脓菌素，或者能够在CN琼脂上生长并且氧化酶呈阳性、紫外光（360±20nm）照射下能发荧光、能够利用乙酰胺产氨的革兰氏阴性无芽孢杆菌，经证实为铜绿假单胞菌，则其检测结果为阳性。第九页，共三十四页，编辑于2023年，星期四培养基和试剂•假单胞菌琼脂基础培养基/CN琼脂（低温避光保存）•金氏B培养基（低温避光保存）•乙酰胺肉汤•营养琼脂•氧化酶试剂•钠氏试剂（配制好之后低温避光保存）第十页，共三十四页，编辑于2023年，星期四

设备和仪器•玻璃器具：所有玻璃器皿使用前需121℃高压蒸汽灭菌15分钟•恒温培养箱：36℃±1℃•紫外灯：波长应为360±20nm•滤膜：直径47mm，微孔径为0.45μｍ

（处理方法：如滤膜未经灭菌，则使用前需先将滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中煮沸灭菌3次，每次15min。前两次煮沸后需更换水，用蒸馏水洗涤2次～3次，以除去残留溶剂。建议使用一次性无菌滤膜。）•显微镜：10×～100ו冰箱：0℃～8℃第十一页，共三十四页，编辑于2023年，星期四第十二页，共三十四页，编辑于2023年，星期四第十三页，共三十四页，编辑于2023年，星期四操作步骤-水样过滤在100级的洁净工作台进行过滤操作。首先用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，固定好滤器，将250mL水样或稀释液通过孔径0.45μm的滤膜过滤，然后将过滤后的滤膜贴在已制备好的CN琼脂平板上，平铺并避免在滤膜和培养基之间夹留着气泡。第十四页，共三十四页，编辑于2023年，星期四第十五页，共三十四页，编辑于2023年，星期四第十六页，共三十四页，编辑于2023年，星期四结果观察培养20h～24h观察滤膜上菌落的生长情况并计数，防止因为培养导致菌落过分生长而出现菌落融合。（40h～48h时更容易观察产色素情况和荧光情况）。第十七页，共三十四页，编辑于2023年，星期四第十八页，共三十四页，编辑于2023年，星期四第十九页，共三十四页，编辑于2023年，星期四第二十页，共三十四页，编辑于2023年，星期四可疑菌落计数情况•计数所有显蓝色或绿色（绿脓色素）的菌落，初步判定为铜绿假单胞菌。•计数滤膜上所有发荧光不产绿脓色素疑似铜绿假单胞菌菌落，并进行乙酰胺肉汤确定试验。（在紫外线下检查滤膜时，应避免长时间在紫外光下照射，否则可能会将平板上的菌落杀灭，而导致无法在证实培养基上生长。）•将其它所有红褐色不发荧光的菌落进行氧化酶试验、乙酰胺肉汤、金氏B培养基确证实验。第二十一页，共三十四页，编辑于2023年，星期四第二十二页，共三十四页，编辑于2023年，星期四纯化•营养琼脂：将需验证的可疑菌落划线接种营养琼脂培养基，于36℃±1℃培养20h～24h，对可疑菌进行纯化。第二十三页，共三十四页，编辑于2023年，星期四第二十四页，共三十四页，编辑于2023年，星期四将最初显红褐色的菌落进行氧化酶试验•氧化酶试验：•原理：氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶。具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素C氧化，再由氧化型细胞色素C使对苯二胺氧化，生成有色的醌类化合物。•操作：取2～3滴新鲜配制的氧化酶试剂滴到放于平皿里的洁净滤纸上。用铂金丝接种环或玻璃棒，将适量的纯种培养物涂布在预备好的滤纸上。在10秒内显深蓝紫色的视为阳性反应。也可以按照商品化氧化酶测试产品的说明书进行该项测试。第二十五页，共三十四页，编辑于2023年，星期四产氨实验（乙酰胺肉汤）•原理：铜绿假单胞菌产生一种脱酰胺酶，可使乙酰胺经脱酰胺作用释放氨，滴加钠氏试剂（碘化汞钾），氨在碱性条件下与碘化汞钾作用，生成红色的络合物。•操作：将纯培养物接种到装有乙酰胺肉汤的试管中，在36℃±1℃下培养20h～24h。然后向每支试管培养物加入1～2滴钠氏试剂，检查各试管的产氨情况，如表现出从深黄色到砖红色的颜色变化，则为阳性结果，否则为阴性。第二十六页，共三十四页，编辑于2023年，星期四第二十七页，共三十四页，编辑于2023年，星期四产荧光素实验（金氏B培养基）•原理：蛋白胨提供氮源，磷酸盐促进荧光素的产生并抑制绿脓色素的产生，硫酸镁为荧光素的产生提供必须的阳离子，琼脂是培养基的凝固。•操作：将上述呈红褐色的且氧化酶反应呈阳性的培养物接种于金氏B培养基上，于36℃±1℃恒温箱培养24h～5d。每天需取出在紫外灯下检查其是否产生荧光性，将5d内产生荧光的菌落记录为阳性。第二十八页，共三十四页，编辑于2023年，星期四第二十九页，共三十四页，编辑于2023年，星期四计数结果说明•菌落计数公式：N＝P＋F(cF/nF)＋R(cR/nR)–P是呈蓝/绿色的菌落数（所有证实为铜绿假单胞菌的菌落）。–F是没有绿脓色素但显荧光的菌落数。–R是呈红褐色的菌落数。–nF是进行产氨测试的显荧光菌落数。–cF是产氨阳性的显荧光菌落数。–nR是进行产氨、氧化酶、金氏B培养基上显荧光测试的红褐色菌落数。–cR是产氨、氧化酶、金氏B培养基上显荧光测试均呈阳性的红褐色菌落数。第三十页，共三十四页，编辑于2023年，星期四举例N=17+16×(2/5)+10×(3/5)–17：呈蓝/绿色的菌落数；–16：没有绿脓色素但显荧光的菌落数；–2：产氨阳性的显荧光菌落数；–5：进行产氨测试的显荧光菌落数；–10：呈红褐色的菌落数；–3：产氨、氧化酶、金氏B培养基上显荧光测试均呈阳性的红褐色菌落数；–5：进行产氨、氧化酶、金氏B培养基上显荧光测试的红褐色菌落数。第三十一页，共三十四页，编辑于2023年，星期四样品稀释

若样品污染严重，建议对样品进行稀释，如10倍递