《大学化学教学》分子生物学研究法

分子生物学研究法（上）1、重组DNA技术发展史上的重大事件2、DNA操作技术3、RNA的基本操作技术4、SNP的理论与应用5、基因克隆技术6、蛋白质组与蛋白质组学与技术整理课件

分子生物学从20世纪中叶开始高速发展，最主要的原因之一是基因操作和基因工程技术的进步。基因操作：DNA的切割和连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析、基因的人工合成、定点突变和PCR扩增。这是分子生物学研究的核心技术。

基因工程：在体外将核酸分子插入载体分子中，使之进入寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。整理课件

跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其他技术的根本特征。本章将在回顾重组DNA技术史上主要事件的基础上，讨论DNA与RNA操作技术、基因克隆技术以及蛋白质组学等几个分子生物学研究方法的关键环节。整理课件重组DNA技术史上的重大事件

半个世纪以来，分子生物学研究取得了前所未有的进步，主要有3大成就:

第一，解决了遗传的物质基础问题-基因的分子载体是DNA;

第二，DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制，解决了基因的自我复制和世代交替问题;第三，“中心法则”和操纵子学说，成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。整理课件DNA分子体外切割与连接技术及核苷酸序列分析技术的进步直接推动了重组DNA技术的产生和发展。重组DNA的核心是用限制性核酸内切酶和DNA连接酶对DNA分子进行体外切割和连接。这些酶的发现和应用是现代生物工程技术史上最重要的事件。限制性核酸内切酶能从特定碱基序列位点切开DNA。

1972，Boyer实验室发现核酸内切酶EcoRI能特异识别GAATTC序列，将DNA在这个位点切开产生具有粘性末端的小片段。整理课件他们还发现，EcoRl酶切产生的任何不同来源的DNA片段能通过粘性末端之间碱基互补作用而彼此“粘合”起来。此后，大量类似于EcoRl但具有独特识别序列的核酸内切酶被陆续发现。到目前为止，科学家已经几乎能随心所欲地把任何DNA分子切割成一系列不连续的片段，再利用凝胶电冰技术将这些片段按照分子量大小逐一分开，以供下一步研究。整理课件整理课件整理课件DNA操作技术

核酸的凝胶电泳1.基本原理生物大分子在一定pH条件下，通常会带电荷。将其放置到电场中，就会以一定的速度移向适当的电极。分子在电场作用下的迁移速度，与电场强度和电泳分子所携带的净电荷数成正比，与分子的摩擦系数成反比。摩擦系数是分子大小、极性及介质粘度的函数。根据分子大小、构型或形状的差异和带净电荷数，可通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离。整理课件

在生理条件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，呈离子化状态，DNA和RNA多核苷酸链称为多聚阴离子，把它们放置在电场当中，会向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度，取决于核酸分子本身的大小和构型。这就是应用凝胶电泳技术分离DNA片段的基本原理。整理课件2.琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖是一种线性多糖聚合物。将琼脂糖粉末加热到熔点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质。经过化学修饰的低熔点琼脂糖，在较低的温度下便会熔化，常用于DNA片段的制备电泳。整理课件整理课件

琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2～50kb之间;聚丙烯酰胺凝胶分辨范围为1～1000bp之间。凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小,浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。例如，20%的聚丙烯酰胺凝胶可分离1-6bp的DNA小片段，而若要分离1000bp的DNA片段，就要用3%的聚丙烯酰胺凝胶。再如，2%的琼脂糖凝胶可分离300bp的双链DNA分子，而分离大片段DNA就要用低浓度(0.3%～1.0%)的琼脂糖凝胶。整理课件

在凝胶电泳中，加入适量溴化乙锭(ethidiumbromide，简称EB)染料对核酸分子进行染色，然后将电泳标本放置在紫外光下观察，检测灵敏快捷，DNA带中含0.05μg的微量DNA，可以清晰地检测出来。EB能插入到DNA或RNA分子的相邻碱基之间，并在300nm波长的紫外光照射下发出荧光。把EB直接加到凝胶介质中，染料便会与DNA分子结合，却不能与凝胶相结合。这样就只有DNA分子能吸收EB并发出荧光。在适当的染色条件下，荧光强度与DNA片段的数量成正比。整理课件整理课件整理课件整理课件载体一．载体的概念：

1.要把一个有用的基因（目的基因-研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。

2.凡来源于质粒或噬菌体的DNA分子，可以插入或克隆DNA片段统称为vector。

3.基因工程所用的vector实际上是DNA分子，是用来携带目的基因片段进入受体细胞的DNA整理课件

二、载体的分类分类依据

类别克隆扩增或表达举例1.按功能分成（1）克隆载体（2）表达载体√√PBR322PCDN32.按进入受体细胞类型分（1）原核载体（2）真核载体（3）穿梭载体PUC8PBUDCE41YE3.按克隆片段得大小（克隆能力）分(1)<1kb(2)<10kb(3)<22kb(4)<50kb(5)0.1-0.4Mb(6)0.5-2Mb(1)M13(2)plasmid(3)λphage(4)casmid(5)BAC(6)YAC√整理课件说明：1.穿梭载体（sbuttlevector）

指在两种宿主生物体内复制的载体分子，因而可以运载目的基因（穿梭往返两种生物之间，如：YEP,DIDB2192.YAC

YeastArtificialChromsome由酵母基因和PBR322质粒衍生物构成，对克隆大的真核基因十分有用，在HGP中发挥主要作用。3.BAC

细菌人工染色体。整理课件三、基因工程载体的3个特点：

（一）都能独立自主的复制载体DNA分子中有一段不影响它们扩增的非必需区域，如MCS，插在其中的外源DNA片段，能被动的跟着载体一起复制/扩增，就像载体的正常成分一样。（二）都能便利的加以检测如载体的药物抗性基因，多是抗生素抗性基因，将受体细胞放在含有该抗生素培养板上培养生长时，只有携带这些抗性基因的载体分子的受体细胞才能存活。（三）都能容易进入宿主细胞中去，也易从宿主细胞中分离纯化出来。

整理课件四、克隆载体和表达载体：所有的载体可以分成两大类：克隆载体和表达载体。其中最常用的是质粒载体。

1.克隆载体（cloningvector）都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。

2.表达载体（Expressionvector）具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs等）还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。为了有效的转录，必需有强大的能够被宿主细胞识别的启动子，为了实现翻译，克隆基因必需有合适的SDs和RbS。这样一个基因表达需要的具有表达和调控能力的载体称表达载体。整理课件（二）载体的元件及性质克隆载体元件以及性质E．coli表达载体哺乳动物质粒细胞表达载体1.Ori

能在受体细胞中复制，含有复制位点（起点）2.Ampr

抗生素抗性基因可以便利加以检测3.MCS

多克隆位点，克隆携带外源基因片段

4.载体可导入宿主细胞（生物学/非生物学方法）1.Ori2.Ampr3.Mcs4.Promoter5.SDsRbs6.Terms7.可导入E.coli1.orip在E.coli中能作复制起始位点2.Ampr

细菌抗生素抗性基因3.Kanr

真核细胞（哺乳类）药物抗性基因4.Orie真核细胞复制起始位点5.Mcs多克隆位点6.P/E启动子/增强子7.Terms终止信号8.加poly（A）信号整理课件抗生素抗性基因：（genotype）编码产物功能（phenotype）（1）Ampr

酶水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。（2）tetr1个膜蛋白可以阻止四环素进入细胞。（3）camr

乙酰转乙酶生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。（4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418失活（5）hygr

潮霉素β磷酸转移酶使潮霉素β失活。整理课件MCS-多克隆位点（multiplecloiningsite，MCS）是多个限制酶识别的一段DNA顺序，以便克隆/插入外源基因/DNA片段。整理课件整理课件整理课件

重组DNA技术的基本过程

基因工程包括3个步骤：1．

DNA重组2．

重组DNA导入宿主细胞－克隆扩增或表达3．

基因工程的后处理（down-streamtechniquesofGE）重组DNA技术的基本过程：1．

载体的选择和制备——分；2．

制备目的基因片段——切；3．

DNA片段的重组连接——接；4．

重组DNA导入受体细胞——转；5．

转化子的筛选——筛；6．

重组子的筛选——筛；7．

重组子的鉴定——鉴；8．

克隆扩增或表达——扩/表达；整理课件(xbalI)EcoRIEcoRI(HindIII)PUC(xbalI)EcoRI(HindIII)EcoRIEcoRI+EcoRIEcoRIEcoRIEcoRIDigestionwithEcoRIRecoveryofAPPAIDNAframagaroseAPOAIPUCQ-APOAIPBR325-APOAIPUC9PUC9APOAIEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIFigure8-3strategyofconstructionofrecombinantpucq-APOAIplasmiaE.coli整理课件PreparationofPBR325—APOAIandPHCoplasmidDigestionofPBR325-APOAIwithEcoRIDiestionofPucowithEcoRIIsolationandRecoveryofAPOAIgenefragmentLabelingofDNAprobewithisotopeorbiotinLigationTransformationofEcoliSelectionofTransformantsIdentificationofplasmidplasmidbyenzymedigestionIdentificationofrecombinatnDNAbysouthernhybridizationFigure8-4TheexperimentalprocessoftheconstructionofrecombinantDNA整理课件

β-半乳糖苷酶失活插入型载体：这种载体的基因组中含有大肠杆菌的lacZ区段，编码β-半乳糖苷酶。由这种载体感染大肠杆菌的lac-指示菌，涂布在补加有IPTG和X-gal的培养基平板上，会形成蓝色的噬菌斑，但在克隆过程中，如果外源DNA插入到lac5区段上，阻断了β-半乳糖苷酶基因lacZ的编码序列，那么由这种重组体感染的lac-指示菌，由于不能合成β-半乳糖苷酶，只能形成无色的噬菌斑。（蓝白斑筛选）整理课件基因扩增

聚合酶链式反应，即PCR技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。它可以在试管中建立反应，经数小时之后，就能将极微量的目的基因或某一特定的DNA片段扩增数十万乃至千百万倍。整理课件PCR技术的原理

首先将双链DNA分子在临近沸点的温度下加热分离成两条单链DNA分子，DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸合成新生的DNA互补链。因为DNA聚合酶需要有一小段双链DNA来启动("引导")新链的合成，所以，新合成的DNA链的起点，由加入到反应混合物中的一对寡核苷酸引物在模板DNA链两端的退火决定的。整理课件整理课件

由一对分别与5‘端和3’端相互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，合成复制模板DNA，使目的DNA得到扩增PCR技术原理5引物A5引物B第二次循环第一次循环555555模板DNA55555555第二次循环第一次循环（接下页）整理课件25～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上5555555555555555第三次循环多次循环整理课件PCR反应的全过程

DNA解链(变性)、引物与模板DNA相结合(退火)、DNA合成(延伸)三步，被不断重复。多次循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA数，即两条引物位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值是2n。整理课件

具体说：首先将含有待扩增DNA样品的反应混合物放置在高温(约94℃)环境下加热1min，使双链DNA变性，形成单链模板DNA；然后降低反应温度(约56℃)制冷1min，使引物与两条单链模板DNA发生退火作用并结合在靶DNA区段两端的互补序列位置上；最后，72℃左右保温1至数分钟，在DNA聚合酶的作用下，从引物的3’-端加入脱氧核苷三磷酸，并沿着模板按5’→3’方向延伸，合成新生DNA互补链。以上循环在同一个PCR管中进行。反应物加完后，温度由PCR仪调整，程序完成后可以拿到产物。整理课件PCR反应系统组分模板DNA（高温变性）TaqDNA聚合酶（耐高温）dNTP（底物）引物（DNA，人工合成）Mg2＋整理课件模板DNA

DNA、RNA都可作模板

,如果是RNA，可以先反转录成cDNA再作模板。模板DNA用量为102-105拷贝,1ug人基因组DNA=3x105单拷贝整理课件长度:15-30mer（mer:核苷酸数）(G+C)含量:40-60%,根据其含量计算退火温度

Tm=4(G+C)+2(A+T)引物序列:一对引物之间不能有互补序列引物的3端:必须严格互补引物的5端:可以不严格,可以加酶,加标记物,引入突变位点等引物的浓度:0.2-1umol/L特异性引物整理课件PCR的早期,用大肠杆菌DNA聚合酶I的Kleenow片段，此酶不能耐受高温(93-95℃)，因此要不断添加酶耐热Taq酶来自水生栖热菌(Thermusaquaticus),在72℃可以60核苷酸/S的速度延伸DNA链。其半衰期:92℃>2hr;95℃40min;97℃5minDNA聚合酶整理课件A．变性95℃，DNA模板变性成为单链，引物自身和引物间局部双链消除B．退火，Tm值减-25℃，使引物与模板DNA结合互补成双链C．延伸，DNA聚合酶在

72℃催化DNA的合成

PCR的基本反应步骤变性95℃延伸72℃退火Tm-5℃PCR仪25-30个循环整理课件PCR的基本原理和操作程序整理课件RT-PCR（逆转录-PCR）

以mRNA为模板，先进行逆转录得到cDNA（complementaryDNA，cDNA），再进行的PCR反应模板为mRNA需逆转录酶产物为cDNART-PCR与PCR区别整理课件RT-PCR的基本原理和操作程序整理课件基因的体外突变DNA和RNA的微量分析DNA序列测定基因突变分析PCR的其他用途整理课件

实时定量荧光PCR技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。实时定量PCR是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量，不需要取出PCR产物进行分离。目前实时定量PCR作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域。实时定量PCR（realtimeRT-PCR）整理课件实时荧光定量PCR技术的主要应用：

1.DNA或RNA的绝对定量分析：包括病原微生物或病毒含量的检测,转基因动植物转基因拷贝数的检测，RNAi基因失活率的检测等。

2.基因表达差异分析：例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异(如药物处理、物理处理、化学处理等)，特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA芯片或差显结果的确证。

3.基因分型：例如SNP检测，甲基化检测等

整理课件原理：根据荧光染料形成特异性荧光信号的强度，计算出模板DNA或mRNA的含量用途：

定量分析mRNA或DNA优点：可进行自动化定量分析、降低假阳性整理课件RealtimePCR常用的两种方法分别为：Sybrgreen（荧光染料掺入法）和Taqmanprobe（探针法）

SYBRgreen

在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

此方法适用：

1、灵敏度高：使用SYBR可使荧光效果增强到1000倍以上

2、通用性好,不需要设计探针,方法简便,省时,价格低廉。

3、通用型方法，在国内外科研中普遍使用。

4、高通量大规模的定量PCR检测

5、专一性要求不高的定量PCR检测。整理课件TaqmanProbe

PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。整理课件实时PCR的基本原理整理课件实时定量PCR的基本过程整理课件此方法适用：

1、具有高适应性和可靠性，实验结果稳定重复性好，特异性更高。

2、适用于扩增序列专一的体系的检测。

3、样品中靶基因含量过低的定量PCR检测。

4、靶基因的特异序列较短，无论怎样优化引物设计条件都不能解决。

5、存在与靶基因同源的序列，在PCR中容易出现非特异性扩增，对特异性要求较高的定量。

6、广泛用于人类传染病的诊断和病原定量,在动物病原体基因的检测,畜禽产品的检验检疫,生物制品的鉴定。整理课件实时荧光定量PCR中的几个术语

1.Ct值：是指每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。（如图所示）整理课件整理课件荧光域值（threshold）：是指PCR反应的前15个循环的荧光信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold。Ct值与起始模板的关系：研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。整理课件基因组DNA文库构建

从生物组织细胞提取出全部DNA，用物理方法（超声波、搅拌剪力等）或酶法（限制性核酸内切酶的不完全酶解）将DNA降解成预期大小的片段，然后将这些片段与适当的载体（常用噬菌体、粘粒或YAC载体）连接，转入受体细菌或细胞，这样每一个细胞接受了含有一个基因组DNA片段与载体连接的重组DNA分子，而且可以繁殖扩增，许多细胞一起组成一个含有基因组各DNA片段克隆的集合体，就称为基因组DNA文库（genomicDNAlibrary）。如果这个文库足够大，能包含该生物基因组DNA全部的序列，就是该生物完整的基因组文库，能从这文库中钓取该生物的全部基因或DNA序列。从基因组含有生物生存、活动和繁殖的全部遗传信息的概念出发，基因组文库是具有生物种属特异性的。整理课件文库构建提取染色体DNA↓DNA片段↓插入适当的克隆载体↓转入受体菌扩增↓基因组文库基因组文库的构建机械法或限制性内切酶切割整理课件整理课件整理课件整理课件基因文库构建示意图整理课件RNA的基本操作技术总RNA的提取RNA提取注意事项：RNA电泳：28S;18S;5SRNA纯度和浓度的测定

整理课件mRNA分离最普遍的mRNA分离依赖于与真核生物mRNA3’端poly(A)互补的含有20-30胸腺嘧啶的oligo[dT]序列。通常将oligo[dT]链通过5’的磷酸键与纤维素基质连接，使用者可以通过其来分离纯化mRNA。Ambion公司提供了几种Poly(A)Purist™mRNAPurificationKit试剂盒，这些试剂盒都是基于oligo[dT]-纤维素原理。GE（AmershamBiosciences）公司也提供了几种利用oligo[dT]-纤维素柱子的mRNA纯化试剂盒。BD生物科学公司和CLONTECH公司同样也提供了oligo[dT]-cellulose试剂盒。CLONTECH公司QIAGEN公司现利用了乳胶磁珠代替了纤维素与oligo[dT]共价连接。乳胶磁珠完美的球形表面能实现均一分布和最小的离心时间，产生纯化的mRNA。整理课件cDNA的合成cDNA第一链的合成

1.寡聚dT法：polyAtail2.随机引物法：整理课件cDNA第二链的合成方法有以下2种:

1、自身引导