基因克隆的酶学基础

基因克隆的酶学基础第1页/共139页限制性核酸内切酶切割DNADNA连接酶生成3’-5’磷酸二酯键DNA聚合酶Ⅰ探针标记、补平3’末端反转录酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5’磷酸化、探针标记末端转移酶3’末端多聚尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基常用的工具酶：第2页/共139页第一节限制性核酸内切酶第二节DNA连接酶第三节

DNA聚合酶第四节DNA及RNA的修饰酶第五节核酸外切酶第六节单链核酸内切酶第3页/共139页一、寄主控制的限制与修饰二、Ⅱ型限制酶的特点三、影响内切酶活力的因素四、核酸内切酶对DNA的消化作用五、限制酶的用途第一节限制性核酸内切酶

与DNA分子的体外切割第4页/共139页一、寄主控制的限制与修饰人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。即所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉。第5页/共139页限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段。各种细菌都能合成一种或几种能够切割DNA双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源DNA存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自身的DNA不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酶，对自身的DNA进行了修饰，限制性酶对修饰过的DNA不能起作用。第6页/共139页修饰的甲基转移酶第7页/共139页作用：保护自身DNA不受限制；破坏外源DNA使之降解第8页/共139页

E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列。第9页/共139页数字表示在不同寄主中生长的噬菌体的成斑率，表示限制程度。第10页/共139页二．限制和修饰作用的分子机制1．大肠杆菌宿主细胞K株，B株，有各自的限制和修饰系统。1）

它们均有三个连续的基因位点控制，hsdR;hsdM;hsdS.2）

hsdR编码限制性核酸内切酶---识别DNA分子特定位点，将双链DNA切断。（DNA分子转化细胞：受体细胞去掉hsdR基因位点）3）

hsdM编码产物是DNA甲基化酶---催化DNA分子特定位点的碱基甲基化反应。4）

hsdS表达产物的功能是---协助限制性核酸内切酶和甲基化酶，识别特殊的作用位点。第11页/共139页第12页/共139页第13页/共139页第14页/共139页反应只需Mg2+的存在，并且具有以下两个特点，识别位点是一个回文对称结构，并且切割位点也在这一回文对称结构上。许多Ⅱ型酶切割DNA后，可在DNA上形成粘性末端，有利于DNA片段的重组。第15页/共139页第16页/共139页二、限制性内切酶的特点

1、定义、命名（1）定义广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指II型限制酶。（2）命名限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。例如：HindⅢ前三个字母来自于菌种名称H.influenzae，“d”表示菌系为d型血清型（菌株号）；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。EcoRI—Escherichiacoli

RI

第17页/共139页第18页/共139页

（2）识别顺序和酶切位点①识别４-8个相连的核苷酸

MboINGATCN

AvaIIGG(A/T)CCBamHIGGATCCPpuMIPuGG(A/T)CCPy

第19页/共139页第20页/共139页估算RE识别序列在DNA上出现的频率:识别序列的频率=1/4n

Sau3A(4bp)=1/44256bp

EcoRI、PstI(6bp)=1/464096

NotI(8bp)=1/4865536(rarecutters)

仅是理论推测第21页/共139页②对称性③限制酶切后产生两个末端，末端结构是5’-P和3’-OH

EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’

第22页/共139页（3）末端种类①3’-端突起，个数为2或4个核苷酸PstI5’-CTGCAG-3’5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’3’-GACGTC-5’②5’-端突起，个数为2或4个核苷酸

EcoRI5’-GAATTC-3’5’-GAATTC-3’

3’-CTTAAG-5’3’-CTTAAG-5’

第23页/共139页③

平齐末端SmaI5’-CCCGGG-3’5’-CCC

GGG-3’3’-GGGCCC-5’3’-GGG

CCC-5’④非互补的粘性末端切点在识别顺序之外的，如：FokIFokI5’-GGATG(Ｎ)9-3’5’-GGATG(N)93’-CCTAC(Ｎ)13-5’3’-CCTAC(N)13能识别简并顺序的，如：AvaI

AvaI5’-CPyCGPuG-3’

CCCGGG、CTCGGG、CCCGA、CTCGAG

第24页/共139页5’粘性末端3’粘性末端平头末端第25页/共139页（4）异源同序酶（isoschizomer，同裂酶）①定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制酶②特点：识别相同顺序切割形成相同的末端

KpnIGGTACCSstICCGCGGAsp718GGTACCSacICCGCGG

第26页/共139页例：限制酶HpaII和MspI共同的靶序列CCGG第27页/共139页（5）同尾酶（isocaudamer）例：BamHI和BglⅡBamHIGGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGGBglⅡAGATCCCCTAGAAGATCCCCTAGA来源各异，识别的靶序列不同，但产生相同的粘性末端第28页/共139页（6）限制片段末端的连接作用①分子间连接分子间连接：不同的DNA片段通过互补的粘性末端之间的碱基配对而彼此连接起来。第29页/共139页分子内连接：同一片段的2个互补末端之间的碱基配对而形成的环行分子。返回第30页/共139页三、影响内切酶活力的因素（1）DNA的纯度污染的蛋白质、酚、氯仿、酒精、EDTA、SDS以及高浓度的盐离子等都有可能抑制核酸内切酶活力。提高效率的方法：①增加核酸内切酶的用量②扩大反应体积，使潜在因素被稀释③延长酶催化时间第31页/共139页（2）DNA的甲基化程度基因克隆中采用失去甲基化酶的大肠杆菌菌株制备质粒DNA。应用：利用核酸内切酶对甲基化序列的敏感性检测序列中的甲基化位点第32页/共139页（3）酶切消化的反应温度大多数核酸内切酶的反应温度在37℃，有些酶例外。（表3-7）酶活力单位：一个活性单位（U），是指在50l反应体系中，37oC的条件下，经过1小时的反应时间，将1gDNA完全酶解所需要的酶量。第33页/共139页（4）DNA的分子结构DNA分子的不同结构对核酸内切酶的活性有很大影响：例如:①切割超螺旋的或病毒DNA比线性的酶用量高出很多倍；②切割不同位点的序列效率会有差异；——可能是由于侧翼序列的影响对于局部消化时要考虑到不同位点的切割效率第34页/共139页（5）核酸内切酶的缓冲液（-20℃保存）主要成分：氯化镁、氯化钠、氯化钾，Tris-HCl，β-巯基乙醇，二硫苏糖醇（DTT）Mg2＋：酶发挥活性必需，不正确的Mg2＋和NaCl会影响对特异序列的识别。Tris-HCl：保证酶反应的pH，一般在pH

7.4条件下功能最佳巯基乙醇：保持某些酶的稳定性第35页/共139页非最适条件下酶的识别序列会发生变化：高浓度的酶，高浓度的甘油、低离子强度、高pH，用Mn2＋代替Mg2＋等甘油的影响（星号活性）例：EcoRⅠ在正常情况下识别GAATTC，但是如果甘油浓度超过5％（V/V），识别序列发生变化，可在AATT或PuPuATPyPy序列处发生切割。返回第36页/共139页四、核酸内切酶对DNA的消化作用完全酶切消化：例如识别6个碱基的酶，可以每隔46＝4096切割一次。切割达到了这样的片段化水平，为限制酶对DNA分子切割完全。局部酶切消化使酶切反应不进行完全，可以通过缩短反应时间，减少酶的用量，降低反应温度等方法约束酶活性。第37页/共139页五、限制酶的用途DNA重组限制酶（物理）图谱绘制

突变分析（RFLP分析）限制酶的部分酶切与完全酶切第38页/共139页酶切图谱的构建第39页/共139页第40页/共139页第41页/共139页例1：限制性消化反应体系。总体积是30μL。5μL质粒DNA1μLEcoRI1μLXbaI3μL10×RE缓冲液20μL水第42页/共139页例2：画一张与这些结果一致的示意图，确切地标明所有限制性酶的酶切位点及它们之间的距离，包含下列所有的信息：（1）限制性酶位点之间要有合适的距离（例如：EcoRI-BamHI=3.3kb）（2）在你的图中央标明质粒的总大小。（3）限制性酶的位点应在与它彼此相对应的正确位置上标明。第43页/共139页BamHⅠ：得到3.3和3.7kbEcoRⅠ：得到5和2kbBamHⅠ和EcoRⅠ：得到3.3，1.7，1.5，0.5kb第44页/共139页3.3kb2kbEcoRⅠBamHⅠ5kb1.7kb1.5kb0.5kb第45页/共139页酶切反应注意事项价格昂贵决不能用水稀释，以免变性失活。预先加入除酶以外的所有其他试剂。取酶立即放于冰上。分装小份避免反复冻融。使用无菌的新吸头。少加水，使体积最小，但保证酶液体积不超过总体积的10％，否则酶液中的甘油会抑制酶活性。返回第46页/共139页一、DNA连接酶的种类及反应条件二、反应机理三、粘性末端DAN片断的连接四、平末端的连接（1）衔接物连接法（2）DNA接头连接法（3）同聚物加尾连接法五、热稳定的连接

第二节DNA连接酶和DNA分子的体外连接第47页/共139页能够将DNA链上彼此相邻的3’-羟基（OH）和5’-磷酸基团（-P），在NAD+或ATP供能的作用下，形成磷酸二酯键。只能连接切口（nick），不能连接缺口（gap）。而且被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。第48页/共139页dsDNA结构:切口，缺口，断口缺口(gap)切口(nick)断口(cut)3'HOP5'3'HOP5'第49页/共139页nicknick第50页/共139页第51页/共139页一、连接酶的来源1、DNA连接酶大肠杆菌染色体编码的2、T4DNA连接酶大肠杆菌T4噬菌体DNA编码的

DNA连接酶－－NAD+T4DNA连接酶－－ATP第52页/共139页从T4噬菌体的受感染细胞中提取，是由T4噬菌体基因组所编码。特点：

只连接dsDNA分子，要求3’-羟基和5’-磷酸基

用途：

1)相同或相容粘性末端的连接

2)平整末端的相连

DNA平端来源：限制酶作用结果;限制酶与其它酶共同作用结果。平端的连接比粘性末端的连接要困难得多，所需的酶量也多。

返回第53页/共139页DNA的腺苷酸复合物3’-OH对P原子作亲核攻击形成磷酸二酯键此反应是由焦磷酸(ppi)的水解作用激发的需要花费两个高能磷酸键（赖氨酸残基）二、反应机理返回第54页/共139页三、粘性末端DAN片断的连接由于具粘性末端的载体易发生自连。对载体的5’末端进行处理，用细菌的或小牛肠的碱性磷酸酶移去磷酸基团，使载体不能自连。而外源片断的5’-P能与载体的3’-OH进行共价键的连接。这样形成的杂种分子中，每一个连接位点中载体DNA只有一条链与外源片断相连，失去5’-P的链不能进行连接，形成3’-OH和5’-OH的缺口。第55页/共139页返回第56页/共139页四、平末端DNA片断的连接T4DNA连接酶用末端核苷酸转移酶给平末端修饰之后，再用DNA连接酶连接。常用的连接方法：同聚物加尾法、衔接物法和接头连接法第57页/共139页

1、同聚物加尾法用5’末端特异的核酸外切酶处理DNA片断在A和B分别中加入dATP和dTTP，末端转移酶加上同聚物尾巴10~40个碱基Klenow酶补平末端第58页/共139页第59页/共139页将衔接物分子与平末端DNA分子连接，再用限制性核酸内切酶酶切，便可产生粘性末端。这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切位点。第60页/共139页衔接物连接法第61页/共139页衔接物（linker）是指用化学方法合成的一段由10～12个核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。双衔接物：可以实现定向克隆，防止发生自连，同时对克隆片断的再删除也比较方便。第62页/共139页第63页/共139页第64页/共139页在用DNA衔接物连接法时，如果待克隆DNA的片断或基因内部，含有与所加衔接物相同的限制位点，在酶切消化衔接物产生粘性末端的同时，也会把克隆的基因切断。第65页/共139页3、DNA接头（adapter）连接法1978年，美国康奈尔大学生化分子生物学系的教授吴瑞博士发明的。是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片断。GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG第66页/共139页粘性末端容易通过碱基配对形成如同衔接物一样的二聚体分子。对DNA接头分子末端，进行必要的修饰。移走粘性末端5’-P，暴露出5’-OH，不能产生稳定的二聚体分子。第67页/共139页DNA接头连接法返回第68页/共139页五、热稳定的连接

从嗜热高温放线菌的菌株中分离出来的。能在高温下催化两条寡核苷酸探针发生连接用的一种核酸酶。使用这种连接酶进行体外连接，可以明显降低形成非特异性连接产物的机率（1）寡核苷酸连接测定

（oligonucletideligationassay,OLA）用两个寡核苷酸探针（20~25bp），同已知序列靶DNA杂交，探针在靶DNA分子的位置是相邻的。

第69页/共139页待扩增的DNA片断PPBBDD地高辛配基生物素磷酸BBBBDDPP阳性信号无信号链霉抗生物素蛋白由于碱基错配不能形成磷酸二酯键检测单碱基的取代、插入、及缺失而引起的多态性AGTGACCTTCACTGGABAGTGACCTAGTTACCTACCTACCTAGTGACCTAGTGACCT偶联碱性磷酸酶的抗地高辛抗体5’3’洗涤后加入碱性磷酸酶底物第70页/共139页（2）连接酶链式反应（ligasechainreaction,LCR）也叫连接扩增反应（ligaseamplicationreaction），用寡核苷酸探针通过DNA连接酶的作用扩增已知序列的靶DNA的方法。需要4种引物。第71页/共139页样品DNA、4种极大超量的探针、NAD，pH7.8混合94℃变性55℃退火，使探针与模板杂交DNA连接酶连接热稳定的DNA连接酶连接热稳定的DNA连接酶连接第72页/共139页①裂口连接酶链式反应（G-LCR）连接酶链式反应中存在独立于靶DNA的连接作用G-LCR可以避免独立于靶DNA的连接作用，从而使敏感性大大提高寡核苷酸探针已经被修饰过，具有交错末端退火后两个探针间用热稳定的DNA聚合酶补齐后连接。第73页/共139页②不对称裂口连接酶链式反应（AG-LCR）可用于检测RNA分子RNA4探针4、热敏感的反转录酶、三种dNTPRNA4432132聚合酶连接酶1探针4发生延伸反应，到混合物中没有补充所需的dNTP反应终止，延伸了9-15个核苷酸探针1与探针2杂交，发生延伸反应返回第74页/共139页第75页/共139页常用的DNA聚合酶

大肠杆菌DNA聚合酶

大肠杆菌DNA聚合酶Ｉ的Klenow大片段

T4DNA聚合酶

反转录酶

T7DNA聚合酶第三节DNA聚合酶第76页/共139页一、E.coli

的DNA聚合酶系统polI

参与DNA修复，具3’→5’和5’→3’外切酶活性polII参与DNA修复，具3’→5’外切酶活性polIII参与DNA复制，具3’→5’和5’→3’外切酶活性第77页/共139页1957年，美国的生物学家A.Kornberg首次证实，在大肠杆菌提取物中存在一种DNA聚合酶，即现在所说的DNA聚合酶Ｉ。由polＩ基因编码的一种单链多肽蛋白质，分子量为109103dal。（一）DNA聚合酶I（PolI）第78页/共139页1、E.coliPolI的特点（1）具两种外切酶活性和DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的片段，其中小片段具5’→3’外切酶活性，大片段具3’→5’外切酶活性和聚合酶活性（大片段亦称为Klenow片段）。（2）聚合酶活性5’→3’,要求3’-OH引物和模板DNA，其延续性受反应条件的影响第79页/共139页（3）DNA聚合酶Ｉ发挥作用的条件：底物：四种脱氧核苷5’-三磷酸（dNTP）；Mg2＋离子；带有3’-OH游离基团的引物链；DNA模板：单链，双链（糖-磷酸主键上有一个或多个断裂）。

第80页/共139页第81页/共139页5’→3’外切酶活性第82页/共139页

DNA聚合酶Ｉ的3’→5’核酸外切酶活性能催化DNA链发生水解作用，从DNA链3’-OH末端开始向5’方向水解DNA，并释放出单核苷酸分子。对酶活的影响：反应物中缺乏dNTPs时，大肠杆菌DNA聚合酶Ｉ的3’→5’核酸外切酶活性，将会发挥作用。但对于底物是双链的DNA，在具有dNTPs时，这种降解活性将会被5’→3’的聚合酶活性所抑制。

第83页/共139页第84页/共139页2、DNA聚合酶在分子克隆中的主要用途除去3’-端突起的单链DNA（在无dNTP时）补齐5’-突起端（常用Klenow大片段）合成第二条cDNA（常用Klenow大片段）切口移位制备探针第85页/共139页（1）通过DNA缺口转移，制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的DNA探针。DNA切口平移（nicktranslation）第86页/共139页缺口双链链的取代缺口转移在DNA分子的单链缺口上，DNA聚合酶Ｉ的5’→3’核酸外切酶活性和聚合作用可以同时发生。当外切酶活性从缺口的5’一侧移去一个5’核苷酸之后，聚合酶作用就会在缺口的3’一侧补上一个新的核苷酸，但PolＩ不能在3’-OH和5’-P之间形成磷酸二酯键，随着5’一侧的核苷酸不断移去，3’一侧的核苷酸又按序列增补，缺口沿着DNA分子合成的方向移动。第87页/共139页DNA杂交探针的制备

典型的反应体系：纯化的特定DNA片断，适量DNaseＩ、PolＩ、α-32p-dNTPs和未标记的dNTPs。

DNaseＩ：造成DNA分子的断裂或缺口；

PolＩ：进行切口转移，使反应混合物中的32p标记的核苷酸取代原有的未标记的核苷酸，最终从头到尾都被标记。第88页/共139页DnaseⅠ作用形成单链切口PolⅠ的5’→3’外切活力从5’切去核苷酸5’3’5’5’5’3’5’PolⅠ的5’→3’聚合酶活力在3’加上放射性标记的核苷酸DnaseⅠ作用形成单链切口PolⅠ的5’→3’外切活力从5’切去核苷酸5’3’5’5’5’3’5’PolⅠ的5’→3’聚合酶活力在3’加上放射性标记的核苷酸第89页/共139页

dNTP对PolＩ酶活性的影响在低浓度dNTPs的条件下，PolＩ具有良好的活性，提高dNTPs浓度时，PolＩ则能够更有效的合成DNA。低浓度的32p-dNTPs（2μmol/L）和高浓度的dNTPs（20μmol/L）一般希望有30%左右的32p-dNTPs参入DNA链（DnaseＩ数量）。

第90页/共139页（二）Klenow片段与DNA末端标记Klenow片段由大肠杆菌DNA聚合酶经枯草杆菌蛋白酶的处理之后，产生出来的分子量为76×103dal的大片断分子。仍具有5’→3’的聚合酶活性和3’→5’的外切酶活性，失去了全酶的5’→3’外切酶活性。

第91页/共139页Klenow片段的主要用途

1、修补经限制酶消化的DNA所形成的3’隐蔽末端；

2、标记DNA片断的末端；

3、cDNA克隆的第二链cDNA的合成；

4、DNA序列的测定。第92页/共139页DNA片段末端标记

具有3’隐蔽末端的带标记得的DNA片断

5’GATCT…3’3’A…5’在反应物中加入Klenow聚合酶α-32p-dGTP，一道温育后生成：

5’GATCT…3’3’*GA…5’或是同时加入α-32p-dATP＋dGTP5’GATCT…3’3’*AGA…5’第93页/共139页DNA片断末端标记可以作为用凝胶电泳法测定分子大小的标记样品。因为被标记的DNA片断是同它们的摩尔浓度成比例，而与他们的分子大小无关。所以在限制酶消化过程产生的大小DNA片断都得到了同等程度的标记。不能有效的标记带有5’突出末端DNA分子。返回第94页/共139页二、T4DNA聚合酶1、从T4噬菌体感染的大肠杆菌培养物中纯化出的一种特殊的DNA聚合酶，具有5’→3’的聚合酶活性和3’→5’外切酶活性。5’→3’聚合酶活性，1500nt/min,为PolI的两倍3’→5’外切酶活性，可作用于ssDNA和dsDNA，其切除速度分别为40和4000nt/min第95页/共139页2、在没有脱氧核苷三磷酸存在的情况下，3’外切酶活性便是T4DNA聚合酶的独特功能。作用于双链DNA片断，并按3’→5’的方向从3’-OH末端开始降解DNA。如果反应物中存在一种dNTP时，它的水解作用进行到暴露出同反应物中唯一的dNTP互补的核苷酸时就会停止。

外切酶活性

聚合酶活性

无dNTPdNTP第96页/共139页3、取代合成法标记DNA片断在反应过程中，通过T4DNA聚合作用，反应物中的α-32p-dNTP逐渐地取代了被外切活性删除掉的DNA片断上原有的核苷酸，因此叫做取代合成。3’外切酶活力可以切割dsDNA和ssDNA，dsDNA>ssDNA，要控制降解时间。对DNA分子3’端有控制的降解返回第97页/共139页三、反转录酶1、来源许多RNA肿瘤病毒中分离到这种酶，最常用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒的反转录酶（AMV）2、特点AMV具有α链和β链α链具有聚合酶活性和RNaseH活性β链具有以RNA-DNA杂交分子为底物的5’→3’脱氧核酸外切酶活性第98页/共139页聚合酶活性第99页/共139页RNaseH活性：从5’→3’或者3’→5’方向特异的降解RNA-DNA中的RNA链第100页/共139页3、主要作用以mRNA为模板合成cDNA；用来对5’突出末端的DNA片断作末端标记。返回第101页/共139页四、T7DNA聚合酶1978年，S.Tabor从感染了T7噬菌体的大肠杆菌寄主细胞中纯化出来的一种核酸酶。加工形式的T7DNA聚合酶系：T7噬菌体编码的基因5蛋白质，另一种是大肠杆菌编码的硫氧还蛋白。基因5蛋白质：具有聚合酶活性和3’→5’外切酶活性；硫氧还蛋白：增强基因5蛋白质与模板引物的结合力具有5’→3’的聚合酶活性和很高的单链及双链的3’→5’核酸外切酶活性。第102页/共139页

T7DNA聚合酶的用途1、用于对大分子量模板的延伸合成；（不受DNA二级结构的影响，聚合能力较强可延伸合成数千个核苷酸）

2、通过延伸或取代合成法标记DNA3’末端；

3、将双链DNA的5’或3’突出末端转变成平末端的结构。第103页/共139页修饰的T7DNA聚合酶对天然的T7DNA聚合酶进行修饰，使之完全失去3’→5’的外切酶活性。聚合作用的速率增加了3倍。用途：

1、作为一种DNA序列分析的工具酶：加工性能高；无3’→5’外切酶活性；具有催化脱氧核糖类似物聚合的能力。

2、制备探针；可催化较低水平的dNTP（<0.1μmol/L）参入。

3、有效的填补和标记具有5’突出末端的DNA片断的3’-末端。聚合作用高；失去了3’→5’的外切酶活性。返回第104页/共139页一、末端脱氧核苷酸转移酶二、T4多核苷酸激酶三、碱性磷酸酶第四节DNA及RNA的修饰酶第105页/共139页一、末端脱氧核苷酸转移酶与同聚物加尾1、特点末端脱氧核苷酸转移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase），从小牛胸腺中纯化出来的一种小分子量的碱性蛋白质，在二甲胂酸缓冲液中，能催化脱氧核苷三磷酸进行5’→3’方向的聚合作用，逐个地将脱氧核苷酸分子加到线性DNA分子的3’-OH末端。第106页/共139页不需要模板，可以用含有的3’-OHDNA片段为引物，在3’-OH端加入核苷酸达几百个。它作用的底物可以是具有3’-OH末端的单链DNA，也可以是具有3’-OH突出末端的双链DNA，平末端不是有效底物，如果用Co代替Mg做为辅助因子，可以成为有效底物。第107页/共139页第108页/共139页利用末端脱氧核苷酰转移酶(TDT)给载体和外源基因加上互补的同聚物尾巴2、用途第109页/共139页催化[α-32P]-3’-脱氧核苷酸标记DNA片断的3’末端。可用于测序的终止，因为不含游离的3’-OH末端。催化非放射性的标记物掺入到DNA片断的3’-末端：生物素等，掺入后可产生荧光染料或抗生物素蛋白结合物的接受位点。用于在平头DNA上合成一段寡聚核苷酸，从而形成粘性末端。返回第110页/共139页二、T4多核苷酸激酶与DNA分子5’末端标记1、T4多核苷酸激酶：由T4噬菌体的pseT基因编码的一种蛋白质，最初从T4噬菌体感染的E.coli中分离出来。作用：催化γ-磷酸从ATP分子转移给DNA或者RNA的末端，不受底物分子链的长短限制。第111页/共139页2、正向反应（forwardreaction）碱性磷酸酶处理DNA的5’端使其脱磷酸暴露出5’-OH，多核苷酸激酶将γ-32P-ATP的γ-32P转移到5’-OH，实现末端标记。5’3’POH3’5’OHP碱性磷酸酶5’3’OHOH3’5’OHOH多核苷酸激酶5’3’32POH3’5’OH32Pγ-32P-ATP返回第112页/共139页三、碱性磷酸酶与DNA脱磷酸作用来自于大肠杆菌（bacterialalkalinephosphataseBAP）或小牛肠（calfintestinalalkalinephosphataseCIP），该酶用于脱去DNA（RNA）5’末端的磷酸基团，使5’-P成为5’-OH，该过程称核酸分子的脱磷酸作用。当需要5’端同位素标记或为了避免DNA片段自身连接（或环化）时可进行脱磷酸反应。第113页/共139页第114页/共139页BAP和CIP的区别：CIP优点：在SDS中加热到68℃可以完全失活，比活性比BAP高10～20倍BAP：热抗性酶，终止作用需要酚/氯仿反复抽提返回第115页/共139页核酸外切酶：一类可以从多核苷酸的一端开始按序催化降解核苷酸的酶，可分为单链的核酸外切酶和双链的核酸外切酶。第五节核酸外切酶ssDNAdsDNA大肠杆菌外切酶Ⅰ（exoⅠ）大肠杆菌外切酶Ⅲ（exoⅢ）大肠杆菌外切酶Ⅶ（exoⅦ）λ噬菌体核酸外切酶（λexo）T7噬菌体基因6核酸外切酶第116页/共139页

1、一般特点：

来自于E.coli，分子量28,000kD

2、催化反应类型（1）外切酶活性：3’→5’，产生5’-单磷酸核苷酸和具各种结构的ds-DNA，pH7.6-8.5（一）外切酶III（ExoIII）——dsDNA5'P5'P3'HO3'HOOH3'OH3'P5'P5'5'P3'HO3'HOP5'第117页/共139页外切酶活性特点①反应底物：互补ds-DNA②碱基释放速度：C>>A～T>>G③反应产物：5’-单磷酸核苷和具缺口或5’-端突起的ds-DNA，过渡反应将导致DNA降解第118页/共139页（2）核酸酶H活性：除去DNA-RNA杂交分子中的RNA分子，pH7.6-8.5（3）3’-磷酸酶活性：除去3’-磷酸基后形成3’-OH端，有利于DNA聚合酶反应，pH6.8-7.4（4）内切酶活性：在无嘌呤或无嘧啶处将DNA键切开，pH7.6-8.53'HOP5'P5'3'HORNaseH第119页/共139页3、用途

（1）核酸（DNA）标记配合使用klenow酶

ExoIII

ExoIII

[α-32P]

[α-32P]

dCTP

dCTP

5'PP5'5'PP5'3'HOOH3'3'HOOH3'ExoIII用于DNA标记第120页/共139页（2）基因突变----缺失（3）DNA序列测定时作顺序缺失1234abc1234abc1234abc1234abc1234abc

234abc

34abc

4abc

abcExoIII用于顺序缺失ExoIII优先降解3’端隐蔽的末端exoⅦ降解5’突出端SⅠ第121页/共139页4、使用注意事项正式使用前，测定在一定条件下酶的反应速度在一定条件下，ExoIII不能作用GC富集区（来自于cDNA加尾）第122页/共139页（二）λ噬菌体核酸外切酶（λexo）

T7噬菌体基因6核酸外切酶——dsDNA1、λexo（1）来源：从感染了λ噬菌体的大肠杆菌中纯化而来（2）特点：催化双链DNA自5’-P末端进行逐步的加工水解，释放出5’单核苷酸，但不降解5’-OH5'P5'P3'HO3'HOOH3'OH3'P5'P5'第123页/共139页（3）用途将双链变为单链，供双脱氧测序分析从DNA中移去5’突出端，以便用末端转移酶进行加尾第124页/共139页2、

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