金华市淡色库蚊对杀虫剂的抗性基因提取分析,昆虫学论文

PAGEPAGE6金华市淡色库蚊对杀虫剂的抗性基因提取分析,昆虫学论文为探究导致金华市淡色库蚊抗性变化的分子机制,利用PCR技术对金华市淡色库蚊相关抗性基因进行检测.本研究综合已报道淡色库蚊抗性基因文献和序列等信息,利用生物信息学手段,设计合适抗性基因引物,并利用该引物获得高质量的目的基因片段.共对乙酰胆碱酯酶(ace1),P450超家族(cyp6f1),非特异性酯酶(Est-2),钠离子通道(vssc),糖原分支酶(NYD-GBE),肌球蛋白(NYD-MLC2)等6类基因进行了PCR扩增.1材料与方式方法1.1供试昆虫淡色库蚊金华现场品系1.2试剂UniversalGenomicDNAExtractionKitVer.3.0(大连TaKaRa公司,生产批号:CA1201)、DNAMarkerDL2000(大连TaKaRa公司,生产批号:B2701A)、ExTaqDNA聚合酶(大连TaKaRa公司,生产批号:CKA270113).1.3仪器梯度PCR仪(美国Bio-rad公司,型号PTC-1148),低温高速离心机(美国ThermoMicro公司,型号17R),电泳仪(美国Bio-rad公司,型号PowrPacBasic)等.1.4引物设计与合成根据已报道文献以及抗药性相关基因序列[1-4],采用VerctorNTI进行序列比对,选取保守序列区进行引物设计,扩增片段应基本涵盖已报道的常见基因突变点,引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成(表1).1.5方式方法1.5.1模板提取现场品系以及敏感品系第1代、第2代4龄幼虫各取20只,分别匀浆混匀,按Univer-salGenomicDNAExtractionKit方式方法提取DNA.总DNA提取后,进行琼脂糖凝胶电泳做定性鉴定,保存于-70℃冰箱备用.1.5.2PCR反响体系10PCR缓冲液(含Mg2+)2l,dNTPs(2.5mmol/L)0.4l,TaqDNA聚合酶(5U/l)0.25l,引物(20mol/L)各1l,模板DNA2l,双蒸水补足至20l.1.5.3反响程序94℃5min;94℃0.5min;50℃~60℃0.5min(不同引物进行相应调整),72℃1min,35个循环;72℃5min.1.5.4PCR产物的检测1%琼脂糖凝胶电泳,紫外观察扩增结果.1.5.5测序PCR产物序列测定由上海生工、大连宝生物公司完成.测得序列,利用软件Chromas对照相应峰图进行校对.校对后新序列上传Genbank数据库,Accessionnumbers:HQ540599,HQ540604,HQ540609,HQ540622,HQ540627,HQ540632.2结果2.1PCR扩增利用本课题设计的引物,经PCR扩增条件优化,均扩增到特异目的片段,见图1.扩增片段丰度高,且无非特异性杂带和拖尾现象,可用于测序分析.2.2抗性相关基因序列分析金华现场品系与敏感品系抗性相关基因序列利用Vector序列分析软件进行比对分析.华而不实vssc基因序列差异较大,序列类似度仅有84.1%,但差异序列主要集中在内含子区,外显子序列完全一样;非特异性酯酶Est-2基因现场品系与敏感品系存在4个核苷酸的差异;ace1基因序列现场品系与敏感品系存在2个核苷酸的差异;P450超家族cyp6f1基因序列现场品系与敏感品系存在1个核苷酸的差异;NYD-GBE、NYD-MLC2基因序列现场品系与敏感品系无差异,类似度为100%.见图2.2.3氨基酸序列分析为了进一步了解抗性相关基因序列点突变对金华淡色库蚊现场品系抗性表型的影响,我们利用软件VerctorNTI软件将发生点突变的序列翻译成氨基酸序列,进行比对.结果显示,ace1基因、cyp6f1基因、Est-2基因的点突变均为无意突变,不会导致氨基酸序列变化.3讨论高质量的基因片段的克隆是获得好的序列分析结果的基础和重要前提.用于序列测定的PCR产物一般要求特异度高,不能存在非特异性扩增片段或拖尾现象等.另外,目的片段产量要高,以提高信噪比或提高克隆测序时的转化成功率.国内外关于库蚊抗性基因扩增的文献报道固然较多,但检测方式方法较为混乱[5-8],所以很难直接用于本课题研究.因而本课题在已有文献的基础上,利用生物信息学技术,对相关抗性基因扩增方式方法进行了改进或新建.本研究在设计经过中首先通过Genbank下载相应的抗性基因序列.利用序列分析软件Vector对下载的基因序列进行比对.通过比对,发现目的基因片段区的保守序列,并在该保守序列区检索适于作为引物的序列,进行引物设计.引物设计完成后,利用NCBI的BLAST功能在Genbank库内对相近进行检索,检查其特异性.如发现设计引物与其他基因片段在3段一样碱基6个,即舍弃重新设计.后经试验证明,本研究所用引物均具有较好的特异性.本次用于抗性基因监测的蚊种群主要来自于主城区.抗性表型测试显示[9],金华市淡色库蚊主城区品系对常见杀虫剂的抗性水平,除了氯菊酯,基本接近敏感品系.该结果与抗性基因测序结果相一致.本研究中检测的6个基因片段中,金华市淡色库蚊现场品系与敏感品系的氨基酸序列完全一样.金华市淡色库蚊主城区品系氯菊酯抗性水平明显高于敏感品系.在本研究中抗性基因测序结果无法解释其抗性产生原因,可能已检测的基因片段未覆盖突变位点,或存在其他未知抗性机制.金华市淡色库蚊主城区品系氯菊酯抗性产生机制,还有待进一步研究.以下为以下为以下为以下为参考文献[1]丁矛.昆虫抗药性相关基因芯片的研制及其应用[D].杭州:浙江大学昆虫科学研究所,2006.[2]公茂庆,刘波,胡小邦,等.淡色库蚊Cyp6f1基因的克隆及表示出差异的鉴定[J].中华卫生杀虫药械,2008,14(2):100-104.[3]孙静,钱瑾,孙立新,等.淡色库蚊抗性相关基因Nyd-Gbe基因的克隆与分析[J].南京医科大学学报:自然科学版,2006,26(7):477-480.[4]钱瑾,孙静,孙立新,等.淡色库蚊抗药性相关基因Nyd-Mlc2基因的克隆与分析[J].南京医科大学学报:自然科学版,2006,26(7):473-476.[5]TomaL,MenegonM,RomiR,etal.StatusofinsecticideresistanceinCulexpipiensfieldpopulationsfromnorth-easternareasofItalybeforethewithdrawalofOPcompounds[J].PestManagSci,2018,67(1):100-106.[6]ChenL,ZhongD,ZhangD,etal.MolecularecologyofpyrethroidknockdownresistanceinCulexpipienspallensmosquitoes[J].PLoSOne,2018,5(7):11681.[7]TantelyML,TortosaP,AloutH,etal.InsecticideresistanceinCu-lexpipiensquinquefasciatusandAedesalbopictusmosquitoesfromLaReunionIsland[J].InsectBiochemMolBiol,2018,40(4):317-24.[8]MatamboTS,PaineMJ,CoetzeeM,etal.SequencecharacterizationofcytochromeP450CYP6P9inpyrethro