聚合酶链反应

关于聚合酶链反应第一页，共四十二页，编辑于2023年，星期三2

一.概述聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR),又称无细胞克隆技术，是一种特定DNA片段在体外快速扩增的新方法。数小时达107-108倍1985年，Centus公司KaryMullis发明1993年因此获诺贝尔化学奖第二页，共四十二页，编辑于2023年，星期三3PCR扩增仪第三页，共四十二页，编辑于2023年，星期三4变性5’3’5’3’3’5’3’5’引物复性3’5’3’5’5’3’3’5’P1P2第四页，共四十二页，编辑于2023年，星期三5延伸3’5’3’5’5’3’3’5’P1P2再变性第五页，共四十二页，编辑于2023年，星期三6再复性P1P1P2P2再延伸第六页，共四十二页，编辑于2023年，星期三7P1P1P2P2短片段以指数形式扩增长片段以线性形式扩增最终主产物片段长度在P1-P2之间第七页，共四十二页，编辑于2023年，星期三8PCR循环的主要参数：1.预变性：92°C--95°C，2--5min2.变性：92°C--95°C，30s-1min3.复性：40°C--60°C，20s--2min4.延伸：70°C--75°C，30s--3min5.总延伸：72°C，7min第八页，共四十二页，编辑于2023年，星期三9三、PCR的基本反应步骤变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚C第九页，共四十二页，编辑于2023年，星期三10PCR扩增条件

94℃,5min

94℃,1min

30

55℃,1min

72℃,1min

72℃,7min第十页，共四十二页，编辑于2023年，星期三11第十一页，共四十二页，编辑于2023年，星期三12DNAMarkerNGF←2000bp←1000bp←750bp←500bp←250bp←100bp第十二页，共四十二页，编辑于2023年，星期三13第十三页，共四十二页，编辑于2023年，星期三14第十四页，共四十二页，编辑于2023年，星期三15第十五页，共四十二页，编辑于2023年，星期三16三.PCR反应体系缓冲液提供所需的pH环境DNA模板：欲扩增的DNA样品

dNTP：四种脱氧核苷酸MgCl2：提供Mg++离子引物：根据欲扩增的DNA样品设计耐热的DNA聚合酶：来源于喜热的细菌第十六页，共四十二页，编辑于2023年，星期三17耐热的DNA聚合酶Taq聚合酶喜温性细菌ThermusaquaticusBM5→3聚合活性5→3外切活性

Pwo聚合酶

喜温性细菌Pyrococcyswoesei5→3聚合活性3→5外切活性（校正）耐热1000C2小时

Tth聚合酶

喜温性细菌Thermusthermophilus5→3聚合活性当锰离子存在时具有逆转录酶活性

C.therm聚合酶

喜温性细菌Thermusthermophilus3→5外切活性（校正）当镁离子存在时具有逆转录酶活性第十七页，共四十二页，编辑于2023年，星期三181.PCRbuffer:72C时，反应体系的pH值下降1个单位，接近于7.2MgCl2－

浓度1－2mmol/L，过量引起非特异扩增，不足使酶活性显著降低，导致产物量少；2.三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）：是合成的原料，四种的浓度应相等，浓度一般为50—200µmol／L。第十八页，共四十二页，编辑于2023年，星期三193.引物：0.1-1umol/L高浓度－引物二聚体、非特异产物低浓度－产率低4.Taq酶：来自于水生栖热菌（Thermusaquaticus),

最适反应温度为70—75oC。常用浓度为1—2.5U/100ul，浓度过高缺乏专一性，过低则产物产量低。第十九页，共四十二页，编辑于2023年，星期三205.DNA样品按照常用的分子生物学方法制备的DAN或RNA样品，其纯度应能达到实验要求。质量100-500ng不含有蛋白酶、核酸酶、DNA结合酶、Taq酶抑制剂6.石蜡油减少反应液的蒸发第二十页，共四十二页，编辑于2023年，星期三21四.影响PCR的主要因素1.温度参数：模板变性温度--低温不产生单链DNA模板，PCR不启动；超过95C，影响Taq酶活性退火温度

温度高--特异性强，引物与模板结合不

牢，DNA扩增效率下降温度低--产量高，特异性差

Ta=Tm-5=4(G+C)+2(A+T)-5

第二十一页，共四十二页，编辑于2023年，星期三22引物延伸温度：取决于Taq酶最适温度

70-75C

大于1Kb的DNA片段，1min以上，并加入明胶或BSA15-20%甘油有助于2.5KbDNA片段扩增第二十二页，共四十二页，编辑于2023年，星期三23PCR扩增平台期循环到一定次数后，扩增产物不再以指数关系增加，而是以线性关系增加或不增加，称为平台期。提前进入平台期的原因

1.引物量不足

2.dNTP量不足

3.Taq酶失活

4.原始模板数量太多第二十三页，共四十二页，编辑于2023年，星期三24循环次数：25-35次次数太多--核苷酸错配、非特异扩增多进入平台期，增加次数效果不大次数太少--产率低第二十四页，共四十二页，编辑于2023年，星期三252.引物设计引物与待扩增的DNA序列互补的寡核苷酸片段。5’引物又称上游引物，其核苷酸序列与模板5’序列相同。3’引物又称下游引物，其核苷酸序列与模板3’序列互补。第二十五页，共四十二页，编辑于2023年，星期三26引物长度人类基因组有30亿bp，按照统计学的计算，随机组合的17个碱基的核苷酸序列，在人类基因组中可能出现一次。 引物长度一般为20-24个碱基。有时也见50甚至更多的碱基。第二十六页，共四十二页，编辑于2023年，星期三27引物组成： 碱基随机分布，避免聚嘌呤或聚嘧啶的存 在，G、C含量一般在40-60%

引物内部避免形成次级结构如发卡结构 两个引物之间不应互补，避免形成引物 二聚体第二十七页，共四十二页，编辑于2023年，星期三28两条引物应避免有同源序列，以免两条引物竞争模板的同一位点。引物5’端：

可加上酶切位点或荧光素等引物3’端：5-6个碱基与靶DNA严格配对第二十八页，共四十二页，编辑于2023年，星期三293’

‥‥TTCAAGCATCTCCAAGAGTTGGCATACGGTAAG‥‥5’

引物5’GTGAATTCTCTCAACCGTAT3’注：红色部分为限制性内切酶切割位点，碱基与 模版链不完全互补。第二十九页，共四十二页，编辑于2023年，星期三30逆转录PCR（ReverseTranscriptionPCR，RT-PCR）

原理：提取组织细胞总RNA，以其中的mRNA为模板，采用需要的引物，在逆转录酶的作用下反转录成cDNA。再以cDNA作为模板，通过特异性引物，PCR扩增目的基因。应用：分析基因的转录产物；获取目的基因；

合成cDNA探针；第三十页，共四十二页，编辑于2023年，星期三31选取适当的组织，提取总RNA以mRNA做模版加入引物、逆转录酶、dNTP、合成cDNA的第一链逆转录酶水解mRNA链合成cDNA的第二链加入引物、Taq酶，做常规PCR扩增出大量的cDNA分子第三十一页，共四十二页，编辑于2023年，星期三32RT-PCR操作需注意的问题：

1.模版RNA应严格纯化，；

2.避免RNA酶污染；

3.所用与实验有关的物品，需用0.1％的焦炭酸二乙酯（DEPC)浸泡处理。第三十二页，共四十二页，编辑于2023年，星期三33增效PCR（boosterPCR）当扩增少于1000拷贝的模板DNA时会遇到两个问题：一是形成引物二聚体，一是非特异扩增，而特异扩增片段产量降低。对于这种情况，可设置二步PCR，先用较低浓度的引物进行初级PCR，此时由于引物少，形成引物二聚体的可能减少，但它并不影响靶序列的扩增，只是由于引物少产物亦少。约经15～20个循环后补充引物量，以初级PCR产物为模板进行扩增，靶序列的产量将相应增加。第三十三页，共四十二页，编辑于2023年，星期三342.巢式PCR（nestPCR）此时也是进行二步PCR，与上面不同的是，第二级PCR需另行设置反应体系，并应用另外的PCR引物，此时引物的位置位于初级PCR引物的内侧，用初级PCR产物做模板，进行第二步PCR，这样只有初级PCR中特异的扩增片段才能被二级引物扩增。除了达到增效PCR同样的目的外，还提高了最终产物的特异性。第三十四页，共四十二页，编辑于2023年，星期三35巢式PCR采用两对引物进行PCR，其中第二对引物位于第一对引物内。P1上P1下P2上P2下P1上P2上第三十五页，共四十二页，编辑于2023年，星期三36FirstroundprimersFirstroundPCRSecondroundprimersSecondroundPCRGeneofinterest第三十六页，共四十二页，编辑于2023年，星期三37在同一PCR体系中加入数对PCR引物，如果这些引物的退火温度相近，并且所覆盖的区域不重叠，这样的反应体系可同时扩增多个DNA片段。多重PCR常用来检测同一基因的多个外显子的缺失，或在检测缺失设置内对照。3、多重PCR

第三十七页，共四十二页，编辑于2023年，星期三38定量PCR测定靶基因的原始拷贝数目前常用Taqman法.该法的原理是:反应底物中加入荧光探针,探针中的荧光基团与淬灭基团距离近,荧光基团发出的荧光被淬灭基团淬灭,随着反应的进行,结合在靶序列上的荧光探针被Taq酶水解,荧光基团发射的荧光,被监测系统接收。据荧光强度,计算靶基因的原始拷贝数.第三十八页，共四十二页，编辑于2023年，星期三39实时定量PCR技术原理第三十九页，共四十二页，编辑于2023年，星期三40SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的游离的SYBR染料分子不会发射荧光信号，从而保