三维细胞培养简介闫辉

三维细胞培养技术(jìshù)的简介闫辉第一页，共二十五页。目录(mùlù)1三维细胞培养技术的概念2三维细胞培养技术产生的背景3三维细胞培养技术的亮点(liànɡdiǎn)4三维细胞培养模型的建立5三维细胞培养技术的应用6三维细胞培养技术的发展前景第二页，共二十五页。1三维细胞培养技术(jìshù)的概念

三维细胞培养技术(three-dimensionalcellculture,TDCC)是指将具有三维结构不同(bùtónɡ)的载体与各种不同(bùtónɡ)种类的细胞在体外共同培养,使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长,构成三维的细胞载体复合物。三维细胞培养是将细胞培植在一定的细胞外基质中,细胞外基质（extracellularmatrixc，ＥＣＭ)（1）蛋白充当生长支架,使得细胞能够分化产生一定的三维组织特异性结构,所创建的细胞生长环境,则最大程度地模拟体内环境。第三页，共二十五页。2

三维细胞培养技术产生(chǎnshēng)的背景细胞的体外培养,关注的不仅仅是它们的分裂生长,而更为重要的是它们经过传代后能否维持体内的性状。在很多情况下,单层细胞培养技术所取到的研究(yánjiū)结果和体内的情况不符合,因为细胞在体外改变的环境下增生,逐渐丧失了原有的性状。动物实验完全在体内进行,但由于体内的多种因素制约以及体内和外界环境相互影响而变得复杂化,难以研究单一过程。第四页，共二十五页。另外,我们在动物身上所观察到的结果,往往是最终呈现的表现,而非研究者最为关心的中间过程。显然,如何填补单层细胞培养和动物实验的鸿沟,一直是生命科学家思索的问题。尤其是在发育生物学领域,迫切需要建立(jiànlì)一套细胞培养技术,既能生长传代,还能最大程度地维持体内性状,并分化产生新的组织结构,以便全面研究发育过程。随着组织工程的新兴发展,三维细胞培养技术就应运而生了。第五页，共二十五页。3

三维细胞培养技术的亮点①三维培养体系为细胞提供类似体内生长环境的支架或基质，细胞通过紧密连接和/或缝隙连接等连接方式建立细胞间及细胞与胞外基质间的联系，形成一定的三维结构；

②三维培养细胞在基因表达、基质分泌及细胞功能活动等方面与单层培养均有明显差异，而与体内细胞生长情况更为相似；因此，三维细胞培养既能保留体内细胞微环境的物质(wùzhì)结构基础，又能体现细胞培养的直观性及条件可控制性，把体外无细胞及单层细胞培养体系与组织器官及整体研究联系起来。第六页，共二十五页。4

三维细胞培养模型(móxíng)的建立4.1三维基质(jīzhì)胶（2）的种类以及常用基质胶的介绍4.2三维模型的种类4.3常见三维细胞培养模型的建立方法第七页，共二十五页。目前已经知道的基质胶主要有海藻酸钙凝胶、琼脂糖凝胶，这两种凝胶主要适用于悬浮细胞的培养(péiyǎng)，还有一种是血纤维蛋白，将动物细胞和血纤维蛋白原混合，然后加入凝血酶。凝血酶将血纤维蛋白原转化为不溶性的血纤维蛋白，将动物细胞固定在其中。血纤维蛋白可以促进细胞贴壁，因此无论是悬浮细胞还是贴壁细胞都适合。第八页，共二十五页。实验室大量使用的基质胶是Matrigel胶，是从小鼠肿瘤组织中提取的抽提物，在室温下，Matrigel可自动聚集产生类似于哺乳动物细胞基底膜的生物活性基质材料。Matrigel基底膜基质形成的三维培养基质，可促进上皮细胞、肝细胞、Sertoli细胞、黑色素瘤细胞、血管内皮细胞、甲状腺细胞及毛囊细胞等的贴壁与分化。同时(tóngshí)，Matrigel还能影响乳腺上皮细胞的蛋白表达，支持外周神经的新生和牛输卵管上皮细胞的分化。高浓度的Matrigel适用于研究体内血管生成和肿瘤细胞迁移及肿瘤模型的建立等。第九页，共二十五页。4.2三维细胞培养模型(móxíng)的种类三维立体培养的方法(fāngfǎ)有多种，常用的有胶内培养模式(细胞与胶原胶混合)、胶上培养模式(细胞生长于胶原胶表面)和三明治培养模式(细胞生长于两层胶原中间)。第十页，共二十五页。4.2常见三维细胞培培养模型(móxííng)的建立方法法胶内培养模模式的建立立方法Matrigel母液浓度10.6mg/mL（3）,放置于4℃溶解(4)。消化细胞,重悬至完全全培养基中中计数,细胞悬液浓浓度为1×106/mL。使用时置置于冰上,用预冷的细细胞重悬液液与Matrigel等体积(tǐjīī)混匀,24孔板中每孔孔加入100μl。37℃放置30min使其成胶,添加完全培培养液。置置于37℃5%CO2细胞培养箱箱中孵育,第二日换液液,此后每隔一一日换液一一次[1]。第十一页，，共二十五五页。胶上培养模模式的建立立方法在24孔培养板中中每孔加入入(jiārù)75µl冰上过夜解冻冻的Matrigel，置于37℃孵箱中孵孵育15min以上使Matrigel聚集。同时时胰酶消化化常规培养养的正常鼻鼻咽细胞及及其高转移移潜能亚株株5-8F,计数后离心心收集细胞胞.然后把细胞胞悬浮于含含2%Matrigel的Keratinocyte-SFM培养养液液中中，，细细胞胞浓浓度度为为2*104/ml用加加样样枪枪吹吹打打成成单单个个细细胞胞后后,每孔加入400µl细胞悬液于已已经凝固的Matrigel上，置于含5%CO2的37℃孵箱中培养，每3-4天换新鲜培养液[2]。第十二页，共共二十五页。。三明治培养模模型的建立方方法三明治模式前前期工作和凝凝胶上模式相相同,不同之处在于于凝胶上的细细胞经培养融融合至(70、80)%左右时,吸去培养液,用无菌PBS冲洗两次后添添加(tiānjiā)第二层胶(200µl/孔),在37℃下培养30min使其凝固后,再在胶原凝固固面上添加培养液[3]。第十三页，共共二十五页。。三种(sānzhǒnɡ)模型的简单解解释第十四页，共共二十五页。。4.3不同(bùtóónɡ)模型的比较对于胶上培养养模式，细胞可以黏附附于细胞外基基质表面并向向再造基质胶胶中生长，但但是只有贴近近Matrigel胶的细胞才能能得到固体细细胞外基质的的支撑，其他他不能贴近再再造基质胶的的细胞仍然处处于2D培养条件下，，在培养过程程中不能形成成完全的立体体克隆；对于胶内培培养模式，细细胞直接重悬于完完全融化的Matrigel胶条件下，细胞生长于完全固固态的细胞外外基质中，可可以很好地模模拟体内肿瘤瘤细胞生长微微环境，在培培养过程中形形成了巨大的的、无极性的的球状细胞克隆。所以大大多数的实验验建立三维模模型采用胶内内培养模式，，但相对来说说胶上培养模模式简单一些些，对于操作作的要求低一一些。三种模模型共同的缺缺点(quēdiǎǎn)是无法法对细细胞直直接利利用显显微镜镜进行行连续续的观观察，，需要要对某某一特特定时时间的的胶原原块进进行固固定制制作电电镜标标本。。第十五五页，，共二二十五五页。。BCA2D细胞培培养模模型B细胞生生长(shēngzhǎǎng)于Matrigel胶表面面C细胞重重悬于于Matrigel胶中[4]第十六六页，，共二二十五五页。。5三维细细胞培培养技技术(jììshù)的应用用5.1肿瘤(zhǒngliúú)生物学学三维细细胞培培养已已被广广泛运运用到到肿瘤瘤学研研究,在肿瘤瘤的实实验性性治疗疗、肿肿瘤的的侵袭袭性、、转移移和中中心坏坏死的的机制制、肿肿瘤的的血管管形成成和营营养供供给、、体内内基因因表达达的模模拟等等方面面发挥挥了不不可替替代的的作用[5]。同时时可以以研究究不同同细胞胞间的的相互互作用用，观观察两两种不不同的的细胞胞类型型是否否融合合或是是不相相关地地各自自生长长第十七七页，，共二二十五五页。。5.2软骨和和骨组织织成熟的软骨骨细胞胞和干干细胞胞被广广泛用用于三三维细细胞培培养,以再生生损伤伤的软软骨、、骨、、韧带带、肌肌腱和和膝关关节半半月板板。在在培养养系统统中常常加入入一些些生长长因子子,以刺激激分化化,产生组织.5.3循环系系统和和心脏各组织都配备备有大大小各各异的的血管管。如如何在在成熟熟的组组织中中及时时产生生血管管网络络是组组织工工程的的重要要课题;在治疗疗领域域,所关心心的也也是如如何有有目的的地改改变血血管形形成,利用三三维培培养可可以清清楚地地观察察到细胞通过过空间增殖殖(zēngzhí)、迁移和和锚定,最终形成成管状结构。第十八页页，共二二十五页页。6三维细胞胞培养技技术(jìshù)的发展前前景近年来,三维细胞胞培养作作为一项项新兴的的细胞培培养技术术,其与二维维细胞培培养中细细胞的平平面生长长相比,最大的优优势在于于(zàiyú)提供了一一个三维维的立体体微环境境,细胞在这这个微环环境中完完成增殖殖、分化化、运动动、凋亡亡等等一一系列过过程,很大程度度上模拟拟了人体体微环境境中的细细胞状态态,因而具有极极大的可开发性。第十九页，，共二十五五页。尤其是在抗肿瘤瘤研究领域域,模拟肿瘤微微环境,关注肿瘤细细胞外基质质在肿瘤发发生发展过过程中的作作用成为了了一个热点点话题。三三维细胞培培养技术,恰恰为肿瘤瘤细胞的生生长提供(tígōōng)了与人体相相一致的微微环境,因而在为抗抗肿瘤治疗疗寻找新靶靶点等方面面具有不可可替代的价价值,值得进一步步的开发和和利用。但但是必须承承认,目前的三维维培养技术术仍然有待待发展,一方面其成本仍较较高,另一方面由于培养条条件尚处于于亚最佳状状态,细胞的生存存能力和分分化程度有有限,与真实人体体尚存在差差异,所以如何通通过技术上上的继续完完善使培养养条件尽可可能地模拟拟体内,是摆在研究究人员面前前的重要任任务。第二十页，，共二十五五页。注释(zhùshì)（1）细胞外基质质由细胞分泌泌到细胞外外间质中的的大分子物物质，构成成复杂的网网架结构，，支持并连连接组织结结构、调节节组织的发发生和细胞胞的生理(shēnglǐ)活动。在生生物学中，，细胞外间间质或细胞胞外基质是是动物组织织的一部分分，不属于于任何细胞胞。细胞外外间质决定定结缔组织织的特性，，对于一些些动物组织织的细胞具具有重要作作用。它决决定结缔组组织的特性性，为细胞胞的生存及及活动提供供适宜的场场所，并通通过信号转转导系统影影响细胞的的形状、代代谢、功能能、迁移、、增殖和分化，主要要成分包括糖糖胺聚糖、、蛋白聚糖糖，结构蛋蛋白，粘着着蛋白。第二十一页页，共二十十五页。（2）基质胶可可认为是一一种可溶性性的基底膜膜基质。主主要成分包包括：层黏黏连蛋白、、胶原IV等，同时含含TGF-ββ成纤维细胞胞生长因子子、组织纤纤维酶原活活化因子以以及其它在在EHS肿瘤中自然然表达的生生长因子等等。（3）三维胶的最最终浓度，，需要根据据实验条件件(tiáojiàn)进一步的确确定，浓度度的高低不仅影响到凝胶的时时间，同时时影响到细细胞在胶内内存在的状态。（4）Matrigel在22-35℃温度环境下下快速成胶胶，因此溶溶解时在4℃冰上过夜冻冻融（4度时会随着着温度的上上升部分成成胶）。所所有用品在在使用前需需置于冰浴浴，必须使使用预冷的的移液管、、吸头及小小管操作Matrigel。成胶后的的Matrigel可以在4℃24－48小时后重新新呈液态。(5)Matrigel基底膜基质质在室温条条件下，聚聚合形成具具有生物学学活性的三三维基质，，模拟体内内细胞基底底膜的结构构、组成、、物理特性性和功能,基底膜是细细胞外基质质特化而形形成的一种种柔软、坚坚韧的网膜膜结构。第二十二页页，共二十十五页。参考文献[1]冯志华,米坤.Matrigel胶的肺腺癌癌细胞株A549体外三维培培养的实验验研究[J].西部医学(yīx