DNA电泳常见问题分析

DNA泳见问分

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个收整，做业途DNA电泳常见问凝胶电操作注意事1、琼糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。2、凝的制备：凝胶中所加缓冲液应电泳槽中的相一致，溶化的凝胶应及时倒入板中，避免倒入凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡，以免影响电泳结果。3、电泳缓冲液：为保持电泳所需的子强度和应经更电缓冲。4、样品加入量一情况下0.5cm宽梳可加0.5DNA量加量的多少依据加样孔大小及中片段的数量和大小而定当样孔大时样上样量应相应加大,否则会造成条带浅甚至辨认不清;反则应适当减少加样量但上样过会成样超，而致尾弥，于较的DNA此象明显5、DNA样中盐浓度会影响的移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。6、迁率取决于琼脂糖凝胶的浓度迁移分子的形状及大小采用不同度的凝胶有可能分辩范围广泛的分子，制备琼脂糖凝胶可根据分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段DNA的测应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，以提高分辨率。选的实验材料要新鲜，处理时间不易过长加入细裂缓液，胞须匀散以减DNA团形。提的不溶解：不纯，含杂质较多；加溶解液太少使浓度过大。沉淀物太干燥，也将使溶解变得很困难。10.电检时DNA成布：作不；染酸等11.分光光度分析的小于1.8；不纯，含有蛋白等杂质。在这种情况下，应加入SDS至终浓度为，重复步骤～。12.酚/氯/异戊醇抽提后，其上液太黏不易吸取：含高浓度的DNA，加大抽提前缓冲液的量或减少所取组织的量DNA电泳见问题析之一1请问制丙酰凝电胶，凝是TEMED还过硫铵胶时很如解？过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所需的自由基，而TEMED通催化过硫酸铵形成自由基而加速它俩的聚合。胶聚合时间长可能是TEMED失了，过硫酸铵固体时间过久也失效的。一个让PAGE胶快聚合的方法：不要先配AP（过硫酸铵）溶，因为AP很易变质。在保证TEMED和AP质的情况下，每次配胶时，直接称一定量的粉溶入液体状态的PAGE中这样可以保证AP的催化能力，而且可以多加一点。配25ml的PAGE胶加0.03克AP剂，最后加入25ulTEMED，20分左右就可以凝固（当然这个时候拔梳子，会有少量未凝固的PAGE在里形成丝状干扰，使加的样品看起来不太漂亮，但一般不影响跑胶效果和条带的形状和位置）。2DNA泳怎是曲？1、配胶的缓冲液需要和电泳缓冲液不是同时配制.最好是同时配制.泳时缓冲液高过液面1－2mm3

个收整，做业途即可。2、电时压过,可以在电泳前15钟用较低电压3V/cm),等带出孔后比较漂.然后再调电压。3、上时量慢慢加,等样品自然沉降再加电压。3跑出DNA带模？1、DNA降：免核酸酶污染。2、电缓液陈:电泳缓冲液多次使用后，离子强降低值升，缓冲能减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液。3、所电条件不合:电泳时电压不应过20V/cm，温度＜℃巨大DNA链泳，温度应15；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。4、DNA上量多：减少凝胶中DNA上量。5、DNA样盐高：电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。6、有白染：电泳前酚抽提去除蛋白。7、DNA变：泳前勿加热，用NaCl缓液稀释。4有不则迁1、对cos位复性：电泳前于65℃加热5分，然后在冰上冷却分。2、电条不合适：电泳电压不超过20V/cm；温度30℃经常更换电泳缓冲液。3、DNA变：20mMNaClBuffer稀，电泳前勿加热。5跑出DNA条带弱无？1、DNA的上样不够：增加DNA的上样量；聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高上样量可适当降低。2、DNA降：免DNA核酸酶污染。3、DNA走凝：缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度。4、对EB染的，用源不合??用短波长254nm）的紫外光源。6跑出DNA带缺不整怎回1、如是DNA带出凝胶，可以缩短电泳时间或降低电压或增强凝胶浓度。2、分大相近的DNA带易分辨?加电泳时间，核准正确的凝胶浓度。3、DNA变：泳前请勿高温加热DNA，以20mMNaClBuffer稀。DNA链大，常规凝胶电不合?在脉冲凝胶电泳分析。7做电泳后电，目基是489BP的，果次切回后跑泳变500多，快到600？什？有时只靠电泳结果判断是不准确的，同样的片段每次跑的远近会有不同。有经验显示目的片段是1300多果跑到1000的marker面去了来证实片段没有问题做的一个片段也是这样490BP.理论上两个条带一样，可是PCR结显示就是大小不一致。然后回收以后的检测结果又全部都一样了，后来又拿去做了下一个测序，才知道根本没有问题。：为么marker条带常模，法别体带A：出现上述情况，可能有以下个原因：1.marker条出现了降解。请保在使用过程中避免核酸酶污染2.电泳冲液陈旧。电泳缓冲液多次使用后，离子浓度降低，上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果，建议经常更换电泳冲液；4

个收整，做业途3.电条件不合适。电泳时电压应不超过20V/cm，度应低于℃4.marker上量过多请根据说明书选用合适上样量；5.凝质不好。建议使用质量较好的琼脂糖；此外，凝胶凝固不均匀也会导致条带模糊。：为么marker条带现不则条（哑状）A：出现上述情况，多与以下几原因有关电缓冲液陈旧。老化的电泳缓冲液离子浓度降低值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果，建议经常更换电泳缓冲液电泳件不合适。电泳电压应不超过20V/cm电太可能会致条带现规现象外胶量以凝冷时固均也导致该现象出现。为么marker条带非弱者本有带A：出现上述情况可能是1.marker上样量较低，可适当增加上样量2.凝胶质量较差或凝胶固不均匀也会导致电泳条带弱或根本没有条带3.电时间过长导致marker条跑出凝胶，可缩短电时间，降低电压，增加凝胶浓度。：为么marker缺带？A：对于含有较小片段的marker，果出现缺带现象，可能是因为：1.小带跑出凝胶或分子量大小非常相近的条带不易辨认所致，可适当缩短电泳时间，降低电，同时增加凝胶浓度2.凝中EB含量过低，导致大片段结合量太或没有，在紫外光下亮度太低，可适当增加EB用。问题DNA带模糊

适

原因DNA解电泳缓冲液陈旧所用电泳条件不合DNA上量过多DNA样盐过高有蛋白污染DNA变

解决办法避免核酸酶污染电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液电泳时电压不应超过20V/cm温度＜℃巨大DNA链泳，温度应＜15℃；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力减少凝胶中DNA样量电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐电泳前酚抽提去除蛋白电泳前勿加热，用20mMNaCl缓液稀释DNA不规则DNA带移带弱或无DNA带

对于λ/Hindcos位复性电泳条件不合适DNA变DNA的样量不够DNA降DNA走凝胶对于染色的

电泳前于65℃加热5分，然后在冰上冷却5分电泳电压不超过20V/cm温度30℃经更电泳缓冲液以20mMNaClBuffer稀，电泳前勿加热增加的样量；聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高，上样量可适当降低避免的酸酶污染缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度应用短波长（254nm）的紫外光源5

个收整，做业途DNA带缺失

，用光源不合小DNA带走出凝胶分子大小相近的DNA带易分辨DNA变性

缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度增加电泳时间，核准正确的凝胶浓度电泳前请勿高温加热DNA链，以20mMNaClBuffer稀释DNADNA链大

常规凝胶电泳不合适

在脉冲凝胶电泳上分析问题DNAMarker降解DNAMarker无法正确分离条带黯淡条带模糊或弥散条带缺失

可能原因核酸酶污染保存不当琼脂糖质量差电泳缓冲液多次使用后失效核酸浓度过低核酸降解DNA条带被示踪染料掩盖电泳缓冲液多次使用后失效核酸部分降解核酸样品纯度差，含有DNA结合蛋白或高浓度的盐份电压过低，电泳时间过长染色时间过长或拍照前放置过久，DNA条带弥散DNA条带分子量过大分子量接近的DNA条带没有分开电泳缓冲液使用不当电泳时间过长或电压过高，DNA走出凝胶电极插反，DNA走出凝胶6

解决方法每次吸取时更换灭菌枪头将泳缓冲液带入管中；用后密闭4°存4°或-20°C保存，避免多次反复冻融；不可加热使用质量可靠的琼脂糖制胶更换缓冲液增加上样量使用不含核酸酶的试剂和耗材制样品提高上样量免使用与目的片迁移率相同的示踪染料更换缓冲液使用不含核酸酶的试剂和耗材制样品酚/仿抽提乙醇沉淀去除蛋白、盐份等杂质根据凝胶大小和电泳缓冲液类型用适当的电压进行电泳电泳结束后及时观察、拍照使用脉冲凝胶电泳选择适当的凝胶浓度进行电泳SD和TBE缓冲液适于分析较小分子量的DNA片段片段分子不完全分离；TAE冲液不适于分离很小的DNA片段缩短电泳时间，调整电压正确连接电极方向

个收整，做业途条带大小不正确带型异常

核酸降解或形成聚合物λDNA酶切Marker的cos位点复性相同分子量的DNA片段由于结构或序列的差异而有不同的迁率梳子变形，点样孔不在同一水平线上不同样本的上样条件不同上样量过大或过小核酸样品纯度差，含有DNA结合蛋白或高浓度的盐份电泳缓冲液未完全浸没凝胶电压过高或电泳时间过长致使凝胶过热和变凝胶中加入EB造成染色不均凝胶中有气泡或污染物点样孔质量差

加热处理或重新制备样品电泳前C加热分钟，冰上冷却5分钟以后再上样判断DNA