生物化学第二章蛋白质化学物大分子分离纯化主要方法

生物化学第二章蛋白质化学物大分子分离纯化主要方法生物大分子分离纯化的一般步骤

层析法电泳法超离心法超滤盐析（硫酸铵盐析）等点电沉淀有机溶剂沉淀透析│←前处理→│←粗分级→│←细分级→│材料选择与处理细胞破碎（机械破碎、溶涨和自溶、酶解、化学处理）→无细胞提取液→粗产品→→结晶3/21/20232盐析法、有机溶剂沉淀法、重金属盐沉淀法、生物碱或酸类沉淀法、加热变性沉淀法离子交换层析吸附层析凝胶过滤（分子筛）亲和层析等电聚集层析分离纯化方法沉淀法层析法电学法电泳法等电聚焦膜分离技术透析超滤离心法3/21/20233纯度鉴定分子量测定层析法：凝胶过滤;高效液相色谱法(HPLC)电泳法：PAGE、梯度凝胶电泳、等电聚焦电泳等免疫化学法：专一的沉淀线SDS-PAGE电泳法：测定亚基数超速离心：成分均一其它：如,结晶法……3/21/20234定义：利用半透膜把大小分子分开的方法。操作

蛋白质溶液置半透膜袋中，置流动溶剂（如蒸馏水）中，使小分子杂质（如无机盐、单糖、双糖、AA、小肽等透出）蛋白质留于袋中而得到分离。透析3/21/20235透析工作图半透膜原理3/21/202363/21/20237层析技术（chromatography）p148一、层析技术一般原理二、层析技术分类及应用3/21/20238一、层析技术原理

层析技术是一种物理的分离方法。无论何种层析，其系统通常由互不相溶的两个相组成：一是固定相（固体或吸附在固体上的液体），一是流动相（液体或气体）。层析时，利用混合物中各组分理化性质（如吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、溶解度等）的差异，使各组分不同程度地分布在两相中，随着流动相从固定相上流过，不同组分以不同速度移动而最终被分离。样品在层析时的移动速度可用迁移率Rf值表示：

样品原点到斑点中心的距离

Rf=——————————————样品原点到溶剂前沿的距离3/21/20239(一)层析相关概念1.固定相：固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。它对层析的效果起着关键的作用。3/21/2023102.流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体或超临界体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。它也是层析分离中的重要影响因素之一。3/21/2023113.分配系数及迁移率（或比移值）：分配系数是指在一定的条件下，某种组分在固定相和流动相中含量（浓度）的比值，常用K来表示。分配系数是层析中分离纯化物质的主要依据。K=Cs/CmCs:固定相中的浓度，Cm:流动相中的浓度。迁移率（或比移值）是指：在一定条件下，在相同的时间内某一组分在固定相移动的距离与流动相本身移动的距离之比值。常用Rf来表示。3/21/202312相对迁移率：是指在一定条件下，在相同时间内，某一组分在固定相中移动的距离与某一标准物质在固定相中移动的距离之比值。它可以小于等于1，也可以大于1。用Rx来表示。分配系数主要与下列因素有关：①被分离物质本身的性质；②固定相和流动相的性质；③层析柱的温度。3/21/2023134.分辨率（或分离度）分辨率一般定义为：相邻两个峰的分开程度。用Rs来表示。Rs值越大，两种组分分离的越好。当Rs=1时，两组分具有较好的分离，互相沾染约2%，即每种组分的纯度约为98%。当Rs=1.5时，两组分基本完全分开，每种组分的纯度可达到99.8%。如果两种组分的浓度相差较大时，尤其要求较高的分辨率。3/21/2023145.正相色谱与反相色谱正相色谱是指固定相的极性高于流动相的极性，因此，在这种层析过程中非极性分子或极性小的分子比极性大的分子移动的速度快，先从柱中流出来。反相色谱是指固定相的极性低于流动相的极性，在这种层析过程中，极性大的分子比极性小的分子移动的速度快而先从柱中流出。一般来说，分离纯化极性大的分子（带电离子等）采用正相色谱（或正相柱），而分离纯化极性小的有机分子（有机酸、醇、酚等）多采用反相色谱（或反相柱）3/21/2023156.操作容量（或交换容量）在一定条件下，某种组分与基质（固定相）反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量，我们称为操作容量（或交换容量）。它的单位是毫摩尔（或毫克）/克（基质）或毫摩尔（或毫克）/毫升（基质）3/21/202316数值越大，表明基质对该物质的亲合力越强。应当注意，同一种基质对不同种类分子的操作容量是不相同的，这主要是由于分子大小（空间效应）、带电荷的多少、溶剂的性质等多种因素的影响。因此，实际操作时，加入的样品量要尽量少些，特别是生物大分子，样品的加入量更要进行控制，否则用层析办法不能得到有效的分离。3/21/202317二、层析法分类（按分离原理分类）分配层析吸附层析凝胶过滤（分子筛层析）离子交换层析亲和层析

聚焦层析3/21/202318层析法分类（按装置分类）

纸层析薄膜层析

柱层析3/21/202319填充物分部收集玻璃柱洗脱液样品3/21/202320各类层析的原理和载体类别分离原理基质或载体吸附层析

化学、物理吸附硅胶、氧化铝、羟基磷酸分配层析两溶剂相中的溶解效应纤维素、硅藻土、硅胶凝胶层析分子筛效应的排阻效应sepharose、sephadex离子交换层析离子基团的交换反应离子交换树脂、纤维素、葡聚糖亲和层析分离物与配体之间有带配基的sepharose特殊亲和力或sephadex聚焦层析等电点和离子交换作用多缓冲交换剂（与带有多种电荷基团的配体相偶联的sepharose6B）3/21/202321

原理：以吸附剂作为固定相，选择适当的溶剂作流动相。由于各种物质的极性不同，被吸附剂吸附的程度和在流动相中的溶解度不同。层析时，当流动相从固定相上流过时，各组分也就不同程度地被溶解（解吸），然后又再被吸附、再溶解再吸附，从而以不同速度随流动相向前移动。吸附层析（absorptionchromatography）3/21/202322吸附层析根据操作方式的不同，分为柱层析和薄层层析两种填充物分部收集玻璃柱洗脱液样品3/21/2023233/21/2023243/21/202325载体：硅胶氧化铝羟基磷灰石应用：分离纯化蛋白质、酶、氨基酸、核苷酸等生化物质3/21/202326原理：

分配层析是利用混合物(样品)在二种或二种以上的不同溶剂中的分配系数不同而使物质分离的方法分配层析实际上是一种连续抽提方式。如纸层析中滤纸的结合水为固定相，以水饱和的有机溶剂为流动相（展开剂）。分配层析(p148)3/21/202327物质在纸上移动的速度可以用Rf表示：色斑中心至原点中心的距离Rf=──────────────溶剂前缘至原点中心的距离载体：纤维素硅藻土硅胶应用：各种生化物质的分离鉴定3/21/202328凝胶层析（gelfiltration）又称为凝胶排阻层析（gelexclusionchromatography）、分子筛层析（molecularsievechromatography）、凝胶过滤（gelfiltration）、凝胶渗透层析（gelpermeationchromatography）等。3/21/202329原理p303凝胶层析是依据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。3/21/202330载体

葡聚糖凝胶（sephadex）

琼脂糖凝胶（sepharose）应用:

测定分子量脱盐和浓缩分离提纯生物大分子除去热原物质3/21/202331离子交换层析（ion-changechromatography）原理离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化的。离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。3/21/202332分类：根据交换剂上吸附的离子交换基团不同，阳离子交换剂;阴离子交换剂；按其解离度的大小，分为强、中强、弱三种：

3/21/202333磷酸基团（PO3H2）和亚磷酸基团（PO2H）

结合磺酸基团（SO3H）弱酸型

强酸型中等酸型结合酚羟基（OH）或羧基（COOH）

弱碱型

强碱型中等碱型季胺基团（N(CH3)3），

叔胺（N(CH3)2）、仲胺（NHCH3）、伯胺（-NH2）

二乙基氨基乙基（DEAE）

离子交换层析分类阴离子交换剂阳离子交换剂3/21/202334离子交换剂可以分为三部分：(高分子聚合物)基质、电荷基团和平衡离子3/21/2023353/21/202336交换过程2.吸附阶段：样品与反离子进行交换3、4.解吸附阶段：用梯度缓冲溶液洗脱，先洗下弱吸附物质，后洗下强吸附物质5.再生阶段：用原始平衡液进行充分洗涤，既可重复使用12345原始缓冲溶液的反离子样品溶液梯度浓度1.平衡阶段:离子交换剂与反离子结合3/21/2023373/21/2023383/21/2023393/21/2023403/21/202341应用

制备、纯化生物物质定量、定性测定混合物中各组分3/21/202342氨基酸分析仪图解缓冲液泵显色反应管茚三酮泵已分开的氨基酸离子交换柱样品注入口记录仪光电倍增管光源3/21/202343原理欲分离的大分产物质S和相对应的专一物质L(配体)以次级键结合，能生成一种可解离的络合物L—S。其中的L又能与活化的基质M以共价键首先结合，而形成M—L—S复合物。根据L—S之间能可逆地结合与解离的原理发展起来的层桥方法称为亲和层析法。亲和层析（affiuitychromatography）

3/21/202344+待纯化分子配体a.待纯化分子和配体间具有亲和性+基质b.活性基质与配体结合产生亲和吸附剂++杂质c.待纯化分子与亲和吸附剂结合，与杂质分离+d.偶联复合物经解离后，得到纯的待纯化分子配体L基质M待分离物质SL-S复合物3/21/2023453/21/202346应用分离纯化酶、抗原、抗体分离纯化核酸研究酶的结构与功能基质纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、sepharose、sephadex3/21/202347聚焦层析（Chromatofocusing）

该法是在等电点聚焦方法基础上发展起来的，其分离纯化蛋白质的依据是等电点的差异和离子交换行为。蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进行排列的过程叫做聚焦效应。原理3/21/202348pH梯度的形成(由多缓冲剂和多缓冲交换剂形成)是聚焦效应的先决条件，如果一种蛋白质加到已形成pH梯度的层析柱上时，由于洗脱液的连续流动，蛋白质将迅速地迁移到与它等电点相同的pH处。从此位置开始，该蛋白质将以缓慢的速度进行吸附、解吸附，直到在等电点pH时被洗出。在聚焦层析过程中，一种样品分次加入时，只要先加入者尚未洗出，并且有一定的时间进行聚焦，剩余样品还可以加到柱上，其聚焦过程都能顺利完成。3/21/2023491、pH梯度的形成2、蛋白质行为3、聚焦效应3/21/202350层析时的聚焦效应示意图pH梯度溶液的形成示意图蛋白质1（pI=7）蛋白质2（pI=8）流速移动速率3/21/202351几种主要层析方法比较3/21/202352二、电泳技术

电泳的一般原理电泳技术的分类电泳的影响因素常用电泳技术3/21/202353电泳的一般原理

电泳是带电颗粒在电场作用下向着与其电荷相反的电极移动的现象。许多生物分子都带有电荷，其电荷的多少取决于分子组成、性质及其所在介质的pH。如果混合物中各组分的结构组成不同，在某一pH溶液中，各组分所带电荷性质、电荷数量不同，加之其分子量不同，在同一电场的作用下，各组分泳动的方向和速度也各异，而达到分离鉴定各组分的目的。3/21/202354电泳分类（一）按原理分四种1.区带电泳：是当前应用最为广泛的电泳技术。

2.自由界面电泳：这是瑞典Uppsala大学的著名科学家Tiselius最早建立的电泳技术，是在Ｕ形管中进行电泳，无支持介质，因而分离效果差，现已被其他电泳技术所取代。

3.等速电泳：需使用专用电泳仪，当电泳达到平衡后，各电泳区带相随，分成清晰的界面，并以等速向前运动。

4.等电聚焦电泳：由两性电解质在电场中自动形成pH梯度，当被分离的生物大分子移动到各自等电点的pH处聚集成很窄的区带。3/21/202355（二）按支持介质的不同可分为：

1.纸电泳

2.醋酸纤维薄膜电泳3.琼脂凝胶电泳4.聚丙烯酰胺凝胶电泳

5.SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）。3/21/202356（三）按支持介质形状不同

1.薄层电泳；

2.板电泳；

3.柱电泳。（四）按用途不同可分为：

1.分析电泳；2.制备电泳；

3.定量免疫电泳；3/21/202357（五）按所用电压不同可分为：

1.低压电泳：100V～500V，电泳时间较长，适于分离蛋白质等生物大分子。

2.高压电泳：1000V～5000V，电泳时间短，有时只需几分钟，多用于氨基酸、多肽、核苷酸和糖类等小分子物质的分离。（六）按pH的连续性不同可分为：1.连续pH电泳：如纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳；2.非连续pH电泳：如聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳；3/21/202358电泳技术分类（按实验装置分类）

纸电泳

薄膜电泳

凝胶电泳

毛细管电泳3/21/202359毛细管电泳3/21/202360三、影响电泳的因素（一）带电颗粒的物理性状（二）支持物介质：（三）缓冲溶液(pH离子强度)（四）电场强度：（五）电渗现象：（六）焦耳热对电泳的影响3/21/202361I=1／2ΣCZ2(式中：I为离子强度，C为离子的摩尔浓度，Z为离子的价数)。3/21/2023623/21/202363四、常用电泳技术1、醋酸纤维薄膜电泳2、聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE）3、SDS4、PAGE等电点聚焦3、琼脂糖电泳4、毛细管电泳3/21/202364聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）

凝胶聚合反应及催化系统

不连续PAGE

可产生的三种效应：电荷效应、分子筛效应、浓缩效应3/21/202365聚丙烯酰胺凝胶电泳（PolyacrylamidegelelectrophoresisPAGE），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺（CH2=CHCONH2Acrylamide）和甲叉双丙烯酰胺（CH2(NHCOHC=CH2)2N,N’-methylenebisacrylamide）聚合而成，这一聚合过程需要有自由基催化完成。3/21/202366光聚合催化剂是核黄素，核黄素在光照下能够产生自由基，催化聚合反应。聚合方式化学聚合通常是加入催化剂过硫酸铵（AP）以及加速剂四甲基乙二胺（TEMED），四甲基乙二胺催化过硫酸铵产生自由基3/21/202367以R代表自由基，M代表丙烯酰胺单体，则聚合过程可以表示为： SOeSOSO282424----·+®+RMMRMM··+®RMRM··+®RMMMRMMM··+®3/21/202368

3/21/202369不连续表现：缓冲液及凝胶pH不连续凝胶孔径不连续电位梯度不连续3/21/202370⊕–电极缓冲液pH8.3

Tris-Gly

分离胶pH：8.9Tris-HCl电极缓冲液pH8.3Tris-Gly

浓缩胶pH：6.7Tris-HCl

样品

3/21/2023713/21/2023723/21/202373SDS

原理：

当SDS（SodiumDodecylSulfate）与蛋白质结合后，蛋白质分子即带有大量的负电荷，并远远超过了其原来的电荷，从而使天然蛋白质分子间的电荷差别就降低乃至消除了。与此同时蛋白质在SDS的作用下结构变得松散，形状趋向一致，所以各种SDS-蛋白质复合物在电泳时产生的泳动率差异，就反映了分子量的差异。在此条件下，样品分子量的对数与其在凝胶中的迁移率呈直线关系。可用下式表示：

LogM=a–b应用:测定蛋白质分子量测定蛋白质亚基数3/21/202374SDSseparatesproteinsbyMW3/21/2023753/21/2023763/21/2023773/21/202378等电点聚焦（isoelectricfocusing）

原理:在一定抗对流介质（如凝胶）中加入两性电解质载体(Ampholyte,是一种多氨基多羧基的混合物，由异构物和同系物组成，其pK和pI值各自相异却又相近），当直流电通过时，便形成一个由阳极到阴极pH值逐步上升的梯度。两性化合物在此电泳过程中，就被浓集在与其等电点相等的pH区域，从而使不同化合物能按其各自等电点得到分离。应用：

高效率分离纯化蛋白质测定蛋白质分子量3/21/2023793/21/202380等电聚焦电泳法测定蛋白质pI3/21/2023813/21/202382毛细管电泳

毛细管电泳又称毛细管区带电泳，它是在毛细管（2-75μm）中装入缓冲液，从其一端注入样品，在毛细管两端加高压直流电实现对样品的分离，分离后的样品依次通过设在毛细管一端的检测器检出。该法克服了传统区带电泳的热扩散和样品扩散的问题，实现了快速和高效分离。

毛细管电泳是近年来发展起来的一项新技术，被认为是90年代最有影响的分离手段之一。目前已广泛用于氨基酸分析、蛋白质高效分离、指纹图谱研究、分离合成的寡核苷酸、DNA序列测定及PCR产物的分析鉴定等。3/21/202383毛细管电泳装置示意图高压电源光源光电倍增管数据采集毛细管缓冲液-样品缓冲液3/21/202384三、离心技术

离心原理离心机分类离心基本方法3/21/202385原理：离心法是利用离心机产生的强大离心力来分离具有不同沉降系数的物质。沉降系数（S）概念3/21/202386沉降系数（S）

生物大分子在单位离心力场作用下的沉降速度称为沉降系数。即沉降系数是微颗粒在离心力场的作用下，从静止状态到达极限速度所需要的时间。其单位用Svedberg，即S表示，S=1×10-13秒。

沉降系数（S）与分子量（M）的关系M=RTSD(1-)Svederg方程:3/21/202387沉降系数（S）

生物大分子在单位离心力场作用下的沉降速度称为沉降系数。即沉降系数是微颗粒在离心力场的作用下，从静止状态到达极限速度所需要的时间。其单位用Svedberg，即S表示，S=1×10-13秒。

沉降系数（S）与分子量（M）的关系M=RTSD(1-)Svederg方程:3/21/202388分析性离心机制备性离心机工业用离心机实验用离心机按用途

普通离心机<6000rpm

高速冷冻离心机20000～25000rpm

超速离心机50000～80000（大于30000）rpm

工业用离心机实验用离心机3/21/202389组成：主机、转头和离心管3/21/202390离心基本方法沉淀离心：差速沉降离心法：密度梯度区带离心法：差速区带离心法等密度区带离心法3/21/202391沉淀离心(pelletingcentrifugation)一般是指介质密度约为1g/ml，选用一种离心速度，使悬浮溶液中的悬浮颗粒在离心力的作用下完全沉淀下来，这种离心方式称为沉降离心。主要适宜于细菌等微生物、细胞和细胞器等生物材料(密度在1.08～1.12g/ml左右)及病毒和染色体DNA(密度在1.18～1.31g/ml左右)等的离心分离。沉降离心与离心力和颗粒大小有关3/21/202392差速沉降离心：采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速度不同的颗粒，在不同的离心速度及不同离心时间下分批分离的方法。此法一般用于分离沉降系数相差较大的颗粒。3/21/202393

密度梯度区带离心法（简称区带离心法）：区带离心法是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。此法