第一章 现代生物技术在生物活性物质开发中的应用

生物资源中生物活性物质的开发与利用

第一章现代生物技术在生物活性物质开发中的应用

1.1概述

主要内容一、应用生物技术的必要性二、生物技术研究的主要内容及优越性一、应用生物技术的必要性1、生物技术：是以生命科学（生物化学和细胞生物学）为基础，利用生物（或生物组织、细胞或其他组成部分）的特性和功能，设计、构建具有预期性能的新物质或新品系，以及与工程原理相结合，加工生产产品或提供服务的综合性技术。2、必要性：①人类对自然资源的过度开发，使自然资源日渐匮乏，可耕作的土地面积和可再生资源日益减少。比如紫杉醇对肿瘤有很好的疗效，但是由于人们对自然紫杉树的过度砍伐，使得这种具有特殊药用价值的资源有被灭绝的危险。②大规模的工业化生产对环境和生态带来严重的甚至是不可逆转的破坏。为了解决这些问题，应用生物技术获取有用的次生代谢产物来满足人们的需求是非常必要的。

二、生物技术研究的主要内容及优越性1、主要研究内容：①基于植物细胞的全能性，借鉴微生物发酵工业的成就和经验，通过高等植物细胞、器官等的大规模培养，生产有用的次生代谢产物。比如华中理工大学对红豆杉细胞的大规模培养来获得紫杉醇。中国药科大学对人参细胞培养来获得人参皂苷等。②利用分子生物学手段对药用植物进行遗传操作，获得转基因植物或转基因组织和器官，如怀特等人培育的转基因绵羊，羊奶中含有抗胰蛋白酶；或者旨在寻找一些次生代谢产物生物合成途径中的关键酶基因，进而对这些次生代谢产物的生物合成过程进行调控或将这些关键酶基因转入微生物中生产人们所需要的次生代谢产物。③应用分子生物学技术进行了药用植物分子标记育种与品质定向调控的研究。2、优越性：①操作培养条件和培养方式，极大地提高生产率，也就是对培养条件进行优化，提高有用次生代谢产物的含量。②培养是在无菌条件下进行的，可以排除病虫害的侵扰，严格控制药材质量。③可以进行特定的生物转化反应，大规模地生产所需要的有效成分。

生物转化就是利用植物悬浮培养细胞或器官中的一些酶对外源化学成分进行结构改造的一门技术，以期得到活性更好，毒性更小或价值更大的先导化合物。④通过对有效成分生物合成路线进行遗传操纵，提高所需物质的产量。⑤通过加入或删除基因而改变原药材的遗传特性。1.2药材的分子鉴定主要内容一、植物药的分子生物学鉴定二、动物药的分子鉴定

一、植物药的分子生物学鉴定1野生及人工栽培中药材资源种植现状（不讲）2、常用鉴定技术（自学）（1）来源鉴定（2）性状鉴定（3）显微鉴定（4）理化鉴定3、分子生物学技术在中草药鉴

定中的应用

分子生物学鉴定技术主要指DNA分析技术，该技术在提取生物的总DNA后，经酶切、电泳，用标记的DNA探针杂交和放射自显影后，根据谱带的特异性而断定药材的真伪。具体应用如下：（1）随机扩增多态DNA技术（randomlyamplifiedpolymorphicDNA,RAPD）多态性：就是多种表现形式

DNA的多态性：指一个生物群体中，DNA分子或基因的某些位点可以发生中性改变，使DNA的一级结构各不相同，但不影响基因的表达，形成多态。多态可以看作是在分子水平上的个体区别的遗传标志。RAPD：用随机合成或任意选定的单一引物在低温条件下与模板DNA序列随机的配对实现扩增，获得DNA指纹图谱，对研究对象的基因组DNA作多态性分析。RAPD在药材鉴定中的具体应用就是：先找出真品特定的DNA片段，对此测序并制备DNA探针来检测相应药材

（2）限制性片段长度多态性分析技术（RFLP）

把药材DNA用限制性内切酶消化后，进行限制性片段长度多态分析，以确定其基因的种属特异性。一般是对药材的DNA的PCR（聚合酶链反应）扩增产物进行限制性片段长度多态性分析，进而研究品种间、属间的DNA变异情况，揭示品种间的亲缘关系，为鉴别药材品种提供科学依据。（3）mRNA差异显示技术（Mrna-differentialdisplaytechnique）

动植物细胞中的许多基因的表达有其特定的模式，即具有细胞或组织特异性。通过将总RNA转录成单链CDNA，进行PCR扩增，挑选出有差异表达的基因进行序列分析。这种方法在中药材的质量鉴定上有广阔的应用前景。CDNA：为具有与某RNA链成互补的碱基序列的单链DNA（4）微卫星DNA技术（sequence-taggedmicrosatellites简称STM）

其基本原理是根据与微卫星重复序列两翼的特征短序列来设计引物，用来扩增重复序列本身。（5）单核苷酸多态性技术（singlenucleotidepolymorphism,

简称SNP）

等位基因是指在一对同源染色体上控制相对性状的一对基因。注意一下相对性状的概念，它是指某种性状的不同表现形式，如同样是颜色，可表现为黑和白两种形式，那么黑和白就是一对相对形状。A和a分别控制显性和隐性形状，所以它们是等位基因。而A和A，a和a控制的都是相同性状，所以它们不能称为等位基因，只能称相对基因。同一位点的不同等位基因之间常常只有一个或几个核苷酸的差异，因此在分子水平上，对单个核苷酸的差异进行检测是有意义的。目前检测SNP的最佳方法是DNA芯片技术。

DNA芯片技术，实际上就是一种大规模集成的固相杂交，是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量预先制备的DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交。通过对杂交信号的检测分析，得出样品的遗传信息。由于常用计算机硅芯片作为固相支持物，所以称为DNA芯片。（6）DNA直接测序技术（DNAsequencing）

即对核酸DNA分子一级结构的确定。这种技术的应用使中药的鉴定技术取得了突破性的进展。

1、蛋白质电泳技术：电泳是指带电粒子在电场中向与自身带相反电荷的电极定向移动现象。电泳技术是色谱技术的一种，常用于样品中不同组分的分离分析。根据支持物的不同，可以把电泳技术分为许多种，比如书中提到的凝胶电泳技术就是以凝胶为支持物，以聚丙烯酰胺凝胶为支持物的电泳技术就称为聚丙烯酰胺凝胶电泳法，简称PAGE。不同蛋白质的质量不同，所带电荷不同，通过电泳技术使不同蛋白质在同一电场中进行分离，然后根据谱带数目、宽窄、位置以及染色程度来辨别药材的真伪和优劣。二、动物药的分子鉴定2、DNA分子标记技术

就是应用NDA序列分析法对中药材的分子进行标记鉴别。该法是先进行中药材DNA的PCR扩增，然后进行DNA序列的分析研究。例如：

LiuZ等在12SrRNA基因片段序列的基础上,设计了等位基因特异性引物,用PCR技术对9种蛤蚧药材样品进行分析,结果显示其中3种为正品蛤蚧,与形态鉴定和DNA序列分析结果一致。一、药用植物基因库的建立二、生物技术与药用植物优良品种的选育三、药用植物关键酶基因与代谢途径1.3

生物活性物质的基因工程

主要内容

基因工程又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因，按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特征，获得新品种，生产新产品。一、药用植物基因库的建立

基因库是一个群体中所有个体的基因类型的集合。药用植物基因库建立以后，即使在某种药用植物灭绝的情况下，其基因也可以通过基因工程加以利用。中药材基因库建立的一般过程是：取入药部位，首先提取其mRNA，构建CDNA文库，对其CDNA文库进行大量分析，筛查出有用蛋白基因，进而克隆这些基因，建立中国自己的基因贮备。药用植物基因库的建立，对我国道地药材的保护和研究具有重要意义。道地药材：中药学术语，指具有明显地域特征、历史悠久、使用考究、产量大、质量优、生产及加工技术成熟的药材。1、新种质资源的来源:①采用常规技术（系谱选择和杂交技术）和高新技术（现代生物技术）相结合，创造出新的物种、品种和品系；②通过自然突变和天然杂交，生殖隔离，产生的新物种、组群和类型；③培育具有某一特异性状的材料，或多种优良性状聚合在一起的综合性状好的材料。二、生物技术与药用植物优良品种的选育（1）传统抗病虫害模式：①通过传统育种方法，培育抗病新品种；②施用化学杀菌剂；③采用倒茬轮作等耕作措施。缺点：成本高、效率差、安全性低（造成环境污染）（2）现代抗病虫害方法——利用生物技术培育抗病性新品种抗病性指植物具有抗病毒、抗细菌、抗真菌和抗线虫基因的植物。由于植物转基因技术的不断改进以及对植物和病原物相互作用的深入了解，利用基因工程技术能同时把多个性状导入感病品种，进而获得具有抗病性的优良品种。例如，广藿香是一种经济价值很高的热带药用植物，但是对于它的青枯病没有一种有效的防治方法。张家明等人用柞（zuo）蚕抗菌肽D基因转入广藿香，产生较强抗病性能的转基因植株。2、病虫害的防治3、利用基因工程技术研制转基因动物和植物，可以定向生产重要的生物活性成分并能创制和改造天然活性成分，使转基因的动、植物成为生产中药活性成分的活体工厂。例如，湖南中医学院等单位将西洋参DNA导入大豆，得到了转基因大豆，并对后代形态、形状变异，异黄酮类化合物（生物活性成分）的含量进行了分析，从中筛选出了有效成分含量较高的新材料。三、药用植物关键酶基因与代谢途径

1、植物抗冻基因的研究：药材的生长对热量、温度等条件要求特别高。冷冻对南药的危害特别大，所以南药不能在北方种植，这就限制了中药材种植的区域范围和时间范围。AFP基因是抗冻基因，通过转基因技术把它导入药材中，改造南药的遗传特征，使其具有抗冻能力，可扩大中药种植的区域范围和时间范围，提高中药的产能。2、次生代谢途径关键酶基因应用酶分析技术，结合同位素示踪的方法进行有关代谢途径基因工程的研究，先搞清次生代谢产物的生物合成途径，找出形成活性成分的关键酶，确定其基因结构，再进行克隆、表达或基因重组以提高酶活性，快速合成所需活性成分；或用反义技术控制某一代谢途径上的关键酶活性，以提高活性成分的含量。例如：中科院植物研究所已克隆出青蒿素的生物合成途径中四个关键酶基因，构建了不同启动子下的Cad和Fpp基因植物表达载体，通过液氮冻融法等技术建立了二元载体系统，并通过Ti和Ri质粒介导的转目的基因的遗传转化，进行了转基因毛状根及芽的分子检测，分析证实，外源Cad和Fpp基因已整合到青蒿毛状根和愈伤组织中，并在转录水平上已有表达，转基因材料青蒿素的含量有显著提高，使青蒿素的生物合成达到了分子调控水平。1.4生物活性物质的细胞工程

主要内容一、动物细胞培养在药物开发中的应用二、药用植物细胞组织和器官培养一、动物细胞培养在药物开发中

的应用

细胞工程：是细胞水平和亚细胞水平的生物工程，是用生物体或其组分（组织或器官）在最适宜条件下生产有益产物或进行有效过程的技术，通过细胞工程可以快速、高效地生产高价值的生物产品或培养有价值的细胞株，并可以产生新的物种或品系。细胞工程包括细胞培养、细胞融合、细胞拆合、核移植、染色体操作及基因转移、细胞大规模培养快速繁殖技术。例如，克隆羊“多莉”就是利用核移植技术培育出来的。主要应用于药物的筛选，有三种模型：

药用动物筛选模型整体动物水平组织器官水平细胞分子水平1细胞分子水平模型的特点

A.与整体水平、器官组织水平模型相比，细胞系的生物学特征较为一致，可用于观察药物对细胞形态及生理特征的影响，从而判断药物疗效及其毒性。

B.材料用量少，药物作用机制比较明确，可以实现大规模筛选，缩短新药筛选周期。

C.为应用自动化操作奠定基础，使药物筛选由传统手工筛选形式转变为由计算机控制的自动化大规模筛选的新技术体系，形成了高通量药物筛选模型（highthroughput,screening,HTS）2细胞分子水平模型的优势

A.大样本量的筛选，使药物筛选工作在尽可能大的对象和范围内进行，这样更容易寻找到高质量的药物。B.实现了一药多筛，使经化学合成或天然产物提取制得的一个新分子能在多个药效模型上得到筛选，从本质上扩大了新药分子的搜寻范围和层次，也有助于从老药中发现新用途。3细胞分子水平筛选模型的缺点

A.由于体内、体外的环境不一样，药物的作用结果也不一样，在体内存在着许多因素可能对药物进行修饰从而导致药物作用的增强或减弱，如由无致癌性转变为具有致癌性，所以在细胞培养条件所得的结果可能不一定完全适用于体内的各种条件。

B.药物对细胞的作用可以有多种表现，但由于检测手段和检测方法的限制，可供药物筛选的指标有限，所以在进行测试时应尽量取多种细胞类型，扩大检测范围。二、药用植物细胞组织和器官培养

植物细胞的全能性：即单个细胞在适宜的环境下可分化发育成植株，并具有整株植物所具有的合成化合物的能力。1植株再生（自学）2植物有效成分的生产有效成分——次生代谢产物次生代谢产物指细胞生命活动或植物生长发育正常运行的非必需的小分子化合物，其产生和分布通常有种属、器官、组织及生长发育时期的特异性（1）生物工程技术进行药用植物有效成分生产的方法a.液体悬浮培养：细胞悬浮于培养基中生长或维持，通过震荡或转动装置使细胞始终处于分散悬浮于培养液内的培养方法。深度超过5mm，需要搅动培养基，超过10cm，还需要深层通入CO2和空气，以保证足够的气体交换。该方法主要用于生产细胞内的有效成分，比如对紫杉醇和紫草宁色素的生产。b.固定化细胞培养：固定化细胞技术，就是将具有一定生理功能的生物细胞，例如微生物细胞，植物细胞或动物细胞等，用一定的方法将其固定（包埋法或吸附法）作为固体生物催化剂而加以利用的一门技术。固定化细胞培养技术主要用于生产那些胞外产生的可自发释放到培养液中的一些有效成分。该技术以其次生物质积累多，易于控制条件，易于收获等优点得到越来越多的关注。如辣椒素的生产，辣椒素是一种天然色素，通过对辣椒细胞的固定化培养，10d就可达3.184mg/L的合成量。c.发酵工程技术：是指采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，或直接把微生物应用于工业生产过程的一种新技术，是用来解决按发酵工艺进行工业化生产的工程学问题的学科。如中国药科大学对人参细胞的培养，建立了日产20~30kg有效成分的生产规模，该产品已作为美容保健品投放市场。（2）植物组织和培养进行工业化过程中的主要问题：a.生产成本高利用植物组织和细胞培养的成本大大高于野生植物采集或种植的生产方式。所以这方面的技术主要应用于资源稀少，活性成分价格昂贵的品种上。b.植物组织和细胞培养与微生物发酵相比，生产速度慢，活性物质产量低。c.适合植物组织和细胞培养的生物反应器尚有待解决，这主要是由于人们对植物组织和细胞在离体培养条件下的生长和发育的规律了解甚少，在设计生物反应器中浓度较高时，培养液成非牛顿流体，如何解决充分混合与均一供养，如何克服剪切力对培养细胞造成的伤害等一系列问题需要进一步探索。

e.对植物次生代谢产物合成途径及所参与反应的各种酶的了解不多，有的甚至连有效成分的化学结构尚未明确，因此对次生代谢的调控有很大的盲目性。

(3)毛状根培养和增殖技术毛状根是发根农杆菌感染双子叶植物后，其Ri质粒上的T-DNA片断整合进植物细胞核基因组中诱导产生的一种特殊表现形式。这是近10年来发展起来的一种新的培养系统。例如：胡之璧等人培养的黄芪毛状根，其皂苷和多糖的含量明显高于黄芪的干燥根。优点：生长迅速，遗传性稳定和生化特性不易改变等。缺点：物质转移问题。虽然转化根可以产生许多化合物，但它们不能产生在地上部分合成的化合物。（4）植物活性成分的生物转化生物转化是利用植物悬浮培养细胞或器官中的一些酶体系对外源化学成分进行结构改造的一门技术，以期得到活性更好，毒性更小或价值更大的先导化合物，例如：利用糖苷水解酶，将人参皂苷Rb1转化成在人参中含量极低、活性更高的人参皂苷Rh2和Rg3.（5）药用植物快速繁殖就是利用组织培养方法将植物体某一部分的组织小块进行培养，并诱导分化成大量的小植株，从而达到快速无性繁殖的目的。优点：繁殖速度快，周期短，不受季节、气候、自然灾害等因素的影响，并可实现工厂化生产。例如，名贵中药材石斛的自然繁殖能力极低，生长缓慢，而对它的需求量非常大，造成了野生石斛资源的短缺。我国利用组织培养技术大大加快了石斛的繁殖速度，解决了石斛的来源问题。（6）多倍体育种多倍体是指体细胞染色体组数目在3个或3个以上的个体，多倍体植株具有许多对生产有利的特性，比如：增加有效成分的含量，增强抗逆性等。A.多倍体育种的方法：常用人工诱变的方法来培育多倍体植株，比如化学诱导法，用浓度为0.01%~1.0%的秋水仙素浸泡芦荟的茎段，可以得到四倍体的植株。B.多倍体育种的优点：

a.增强抗逆性；b.增加产量和有效成分的含量，比如四倍体菘蓝叶片中靛蓝和靛玉红的含量和根中氨基酸含量高出二倍体的70%~100%1.5发酵工程技术在药用植物资源

开发中的应用主要内容一、药用植物发酵培养工业化的意义二、药用植物发酵培养的国际发展趋势三、中国药用植物发酵培养的发展现状四、从中药现代化的高度开发药用植物发酵技术五、多领域的合作发酵工程指采用工程技术手段，利用生物（主要是微生物）和有活性的离体酶的某些功能，为人类生产有用的生物产品，或直接用微生物参与控制某些工业生产过程的一门技术。比如：酿酒、制造奶酪和酸奶，是利用发酵技术的典型例子。发酵工程经历了“农产品手工加工——近代发酵工程——现代发酵工程”三个发展阶段。现代发酵工程是一个由多学科交叉，融合而成的技术性和应用性较强的开放性学科。发酵工程技术中的关键设备是生物反应器。生物反应器是指在体外模拟生物体的功能，设计出来用于生产和检测各种化学品的反应装置。或者说，生物反应器是利用酶或生物体（如微生物）所具有的生物功能，在体外进行生化反应的装置系统，是一种生物功能模拟机。比如：人的胃就是一个天然的生物反应器，工程上用的生物反应器有发酵罐，固定化酶或固定化细胞反应器等。

一、药用植物发酵培养工业化的意义1、有助于解决耕地减少的问题：中药材的来源主要是依靠野生资源和大田种植，而我国是一个人均可耕地面积较少的国家，大量的土地用于种植药材，占用了粮食生产用地。2、有助于解决“老参地”问题“老参地”指种植过一茬人参的土地。由于人参不能连作，种过一茬后的土地要放置一段时间甚至几十年才能再种植。为了开辟新的土地资源，大量的山林被砍伐，造成水土和植物多样性的流失。二、药用植物发酵培养的国际发展趋势1、历史：1980年，Zbaraki用工业化发酵技术成功地培了人参细胞，反应器的规模达到20t。1985年Tabata在紫草细胞工业化培养生产紫草素上获得成功，这在药用植物发酵培养的历史上具有里程碑的意义。近两年，韩国科学家在高丽参的器官培养的工业化方面也获得了成功，反应器规模达到了10t。2、趋势：（1）“热门”药用植物的培养方兴未艾“热门”药用植物是指所包含的有效成分对人类重大疾病有明显的疗效，价值高而被大家关注的植物。比如，红豆杉中有效成分紫杉醇有很好的抗癌效果，长春花中的长春新碱对白血病有很好的疗效。但它们在植物中含量很低，仅为十万分之一或百万分之一。同时，由于紫杉醇和长春新碱的化学合成步骤复杂，也不能用化学方法解决问题，所以有必要开展生物技术，实现红豆杉和长春碱细胞的发酵培养的工业化。（2）药用植物的器官培养异军突起器官培养主要指植物的根、茎、叶、花及果实等器官在离体条件下的无菌培养。器官培养的特点在于能保持器官具有的特征性结构。比如，韩国在高丽参的不定根和毛状根的发酵培养方面取得了突破性进展，成功进行了产业化。（3）药用植物发酵培养的研究逐渐深化（三个层次）a、基础研究：培养基的筛选、植物生长调节剂的配比、碳源和氮源的考察，培养温度和光照等对培养物生成和次生代谢合成的影响。b、高级研究：药用植物细胞在摇瓶和反应器中生长规律的探讨。细胞在反应器中生长动力学考察，最佳供气条件及对渗透压的影响。前体物质的饲喂和生物转化，诱导物的使用，针对不同个体材料的反应器的研制。c、前沿研究：对药用植物次生代谢机理的研究。对于次生代谢机理的研究，已经深入到活性成分代谢相关酶或关键酶的分子克隆和基因表达调控水平。三、中国药用植物发酵培养的发展现状

1、历史和成果：罗士伟教授是中国研究药用植物发酵培养的第一人，他在20世纪60年代就成功地进行了人参的组织培养。1983年我国召开了第一届药用植物组织培养会议，并在同年出版了《药用植物组织培养》专著。进入90年代，由于迟迟看不到产业化的曙光，许多科学家停止了这方面的研究工作，是这方面的研究几乎陷入停滞状态。所幸的是胡之壁院士等人一直坚持在这一领域不断探索，在国际上首先培育出转化率最高的洋地黄细胞株，也就是著名的“胡氏细胞株”。丁家宜教授以人参愈伤组织为原料开发了系列化妆品，是使药用植物发酵培养产业化的典范。另外，广西药物所的罗汉果的快速繁殖，中科院植物所的紫草毛状根的大规模培养，华中理工大学的红豆杉毛状根大规模培养和上海中医药大学的黄芪毛状根的大规模培养，都是在药用植物发酵培养领域的标志性成果。

2、缺陷和不足：A.研究不重视药用植物活性成分含量的高低，为了研究而研究。B.对中药材大规模培养尚处于探索阶段，反应器规模太小，放大后培养技术尚不成熟。

四、从中药现代化的高度开发药用

植物发酵技术中药现代化简单地说就是从传统中药发展提高到现代化中药。具体地说，中药现代化来源于传统中药的经验和临床，依靠现代先进科学技术手段，遵守严格的规范标准，研究出优质、高效、稳定、质量可控、服用方便、并具现代剂型的新一代中药，符合并达到国际主流市场标准，可在国际上广泛流通。这个过程就是中药现代化。其具体内容包括：中药理论现代化、中药质量标准和规范的现代化，中药生产技术的现代化、中药文化传播的现代化和提高中药产品市场的份额。而现在中药企业和国际上大的制药企业集团相比，规模还很小，要扩大生产规模，首先要从药源上给以保证，而野生药物资源是有限的，必须通过植物发酵培养进行大规模工业化生产，以缓解药用植物资源问题。五、多领域的合作

现代生物技术是一门多学科、多领域交叉、渗透技术，只有不同领域科学家的通力合作，才能取得较大的成果。而这些正是我国生物技术研究领域所欠缺的。正如书中所言，一个生物学家能把细胞养活，一个工程学家能把培养规模放大，一个药学家能分析培养的活性成分并开发产品。三者结合起来，才能真正实现药用植物组织培养的产业化。

1.6现代生物技术在中药生物活性物质开

发中的应用主要内容一、生物工程在活性物质开发中的应用历史二、中药植物细胞培养理论与实践三、提高次生代谢物产量的方法四、药用植物毛状根培养五、药用活性物质的生物转化现代生物技术也称生物工程，是在分子生物学基础上建立的创建新的生物类型或新生物机能的实用技术，是现代生物科学和工程技术相结合的产物，包括基因工程、细胞工程，酶工程和发酵工程等。随着中药现代化的进程，对药用植物资源的用量会不断增加，对野生资源的过量采集导致了中药材资源的濒危和物种的灭绝。同时带来了严重的生态问题。而药材的大田栽培又会导致山林被砍伐，生物多样性的消失，与粮食争夺土地、农药和重金属残留等问题。现代生物技术的应用可以弥补以上的不足。

生物技术在次生代谢物的生物来源方面有如下的应用：

A、植物细胞组织器官培养：细胞培养、不定芽培养、根培养、大规模培养技术

B、转基因植物/生物体：代谢工程、异源表达，分子组成

C、药用植物微繁殖：濒危植物、高产变异株、代谢工程植物

D、新资源：藻类、其他光合海洋生物

E、安全性考虑一、生物工程在活性物质开发中的应

用历史

第一阶段：高等植物组织和细胞悬浮培养，该技术是在1959年，由Tulecke和Nickell

首次将微生物培养的发酵工艺用于高等植物细胞的悬浮培养而建立起来的。用该方法分离的天然产物见P22表1-1

技术优点（与传统农业相比）

a.不受地理、季节变化和各种环境因素的影响；

b.提供确定的生产系统，确保了产品的连续供应，以及产品质量和产量的一致性；

c.可能产生其亲代植物不能产生的新物质；

d.有利于下游提取和生产；

e.能对廉价的前提进行立体和区域专一性的生物转化以生产新化合物。第二阶段：生物反应器的应用。该技术比较复杂、推广缓慢。植物组织与细胞培养与微生物细胞培养的区别见P22表2-2

该技术目前取得的成果：自1956年第一个应用细胞培养技术生产天然产物的专利诞生至今，进行细胞培养的药用植物有200多种，可生产有效成分500多种。最早使该技术实现产业化的是日本的古谷，1968年他们用13，0000L的发酵罐对人参细胞进行工业化生产，获得的活性成分人参皂苷与亲本植物的药理活性基本相同，而皂苷含量却为亲本植物的3倍。1983年日本又成功地实现了紫草宁衍生物的工业化生产，对黄连细胞培养生产小檗碱、长春花细胞生产阿吗碱的规模也已达到5000L。德国对紫松果菊细胞的生产也已实现产业化，用以生产免疫活性多糖。国内的研究也取得了一系列的成果。比如，天大的元英进对红豆杉细胞的培养研究也取得了很好的成果。

P23表1-3植物细胞培养的次生代谢产物含量与原植株的区别第三阶段：毛状根培养系统的建立：通过发根农杆菌感染植物细胞，从而将其Ri

质粒中的T-DNA基因片段整合到植物细胞基因中而形成毛状根。优点：生长快、不需要添加外源植物激素，次生代谢产物含量较高，易于培养。目前为止，已建立起毛状根培养系统的药用植物包括：黄芪、人参、黄芩、栝楼、决明、龙胆、露水草、长春花、粟米草、野葛、银杏、大黄、丹参、青篙、甘草、绞股蓝等二、中药植物细胞培养理论与实践1愈伤组织的诱导（1）愈伤组织：原指植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的组织。它由活的薄壁细胞组成，可起源于植物体任何器官内各种组织的活细胞。在植物器官、组织、细胞离体培养时，条件适宜也能长出愈伤组织。其发生过程是：外植体中活细胞经诱导，恢复其潜在的全能性，转变为分生细胞，继而其衍生的细胞分化为薄壁组织而形成愈伤组织。从植物器官、组织、细胞离体培养所产生的愈伤组织。在一定条件下，进一步诱导器官再生成胚状体而形成植株。在单倍体育种中，也可由花粉产生愈伤组织或胚状体分化成单倍体植株。甚至可由原生质体培养诱导植株或器官再生。故愈伤组织的概念已不局限于植物体创伤部分的新生组织了。（2）愈伤组织的诱导方法：

A选材：幼嫩的根、茎、叶、花或果实

B.消毒：常用消毒剂：NaClO、Ca(ClO)2、升汞（HgCl2）、H2O2、75%乙醇外植体消毒过程中必须掌握好度，消毒不足易染菌，消毒过度则杀伤细胞，一般用75%乙醇浸泡外植体30s~2min或不同消毒剂联合消毒，比如用75%乙醇30s+1%次氯酸钠10min.C.取出消毒剂

D.培养：处理好的外植体置于含适当植物激素的固体培养基上培养，常用的培养基有MS、SH、B5等2高产细胞株的筛选和培养条件的建立最初的愈伤组织合成次生代谢产物的能力不强，基本不能合成，所以要采用下面的方法筛选高产细胞株P25图1-1（1）从原植株上选取合成和积累次生代谢产物的部分作为培养愈伤组织的材料（2）将每块愈伤组织切成若干小块并在含适当激素的培养基中培养10-14d；转移至不含激素的培养基上培养若干天，将其分为两半，一半进行次生代谢物含量分析，另一半继续继代培养（3）待化学分析结果明确后，将次生代谢物含量最高的组织块再切成多个小块，接种、继代培养（4）重复上述筛选程序多次，最终选出高产细胞株3、细胞悬浮培养系的建立及大量培养（1）成功的细胞悬浮培养体系应当满足三个基本条件：A、悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般由几十个以下的细胞组成，但很少有完全由单细胞组成的悬浮细胞系B、均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同，悬浮系外观为大小均一的小颗粒，在倒置显微镜下观察为体积和形状大致相同的细胞团C、生长迅速，悬浮细胞的量一般2~3d甚至更短时间便可增值一倍（2）获得活的小细胞聚集体的方法——从疏松易碎的愈伤组织上获得：疏松易碎的愈伤组织的培养过程：外植体——诱导愈伤组织——在快速生产的培养基上继代培养（培养基中有较高含量的无机氮源，丰富的有机附加物，如，水解酪蛋白，L-脯氨酸、谷氨酰胺和椰奶等，较低浓度的蔗糖）——筛选出颗粒细小、外观湿润，白色或淡黄色的愈伤组织——继代培养——再筛选（反复多次）（继代培养时，每次继代培养的时间间隔要小，7—10d转移一次）——获得疏松易碎的愈伤组织——转移至三角瓶中培养2—3d——过滤；先用500μm孔径的尼龙网过滤，再用60-100μm孔径的尼龙网过滤。4植物细胞生物反应器培养：(1)生物反应器的优点：工作体积大，单位体积生产能力高，物理和化学条件控制方便，提高目的产物产量，生产亲本植物不包含的新药物

P26常用的生物反应器（表1-4）(2)影响生物反应器培养的主要因素：A.合适的氧传递：由于植物细胞培养的高密度和高粘度特性，氧的传递会受阻。尤其是在悬浮培养的初期，培养液的粘度更大。

B.良好的流动性：非牛顿流体流动性差

C.低的剪切力：高剪切力造成细胞损伤，影响细胞形态、代谢和聚集体状态。三、提高次生代谢物产量的方法

主要策略：A.获得生长迅速的细胞系B.筛选生产有益代谢产物的高生长速率细胞系C.固定化细胞，以提高胞外代谢产物产率D.使用诱导子在短时间