植物组织培养脱毒快繁技术在马铃薯育种中的应用

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摘要：脱除病毒是植物组织培养深入探讨研究中的一具技术难题。本文简要介绍植物组织培养的基本原理和办法，综述植物脱除病毒的热处理、茎尖培养和抗病毒药剂三种办法的原理和技术办法，介绍了几种常用的病毒检测办法。本文以马铃薯为例，重点介绍了利用热处理加茎尖组织培养法获得马铃薯脱毒苗的具体技术办法，脱毒率可达100%。并且还对植物组织培养脱毒快繁技术的应用前景作了分析。

关键词：茎尖培养，脱毒快繁技术，病毒检测，应用前景.

1．脱毒技术及其原理

植物组织培养脱毒快繁是人工在无菌条件下利用植物体的一部分，在人工操纵的营养和环境条件下生殖植物，脱除病毒得到无毒苗株，继而在大田快速生殖的技术。脱毒及离体快繁，是目前植物组织培养应用最多、最广泛和是有效的一具方面。如今植物的脱毒技术有多种，其中应用最广泛的有三种：热处理法、茎尖培养脱毒法、抗病毒药剂法，将别同的办法相结合起来应用效果更好。

1.1热处理法

1.1.1概述

热处理法是利用病毒和寄主植物对高温的忍耐性的差异，使植物的生长速度超过病毒的扩散速度，得到一小部分别含病毒的植物分生组织，然后举行无毒个体哺育。

热处理可经过热水浸泡或湿热空气举行。热水浸泡对休眠芽效果较好，湿热空气对活跃生长的茎尖效果较好，既能消除病毒又能使寄主植物有较高的存活机遇。热空气处理比较容易举行，把旺盛生长的植物移入到1个热疗室中，在35~40℃下处理一段时刻即可，处理时刻的长短，可由几分钟到数月别等[3]。热处理的办法有恒温处理和变温处理，处理的材料能够是植株，也能够是接穗。

1.12原理

热处理脱毒是依照病毒与寄生细胞对高温的忍耐程度别同，挑选适当的温度和处理时刻，植物组织中的非常多病毒被部分地或彻底地钝化而可操纵其的活动，但非常少损害甚至别损害寄主组织，从而让植物细胞加快生长，使生长点附近别带病毒，从而达到脱毒的目的。

1.2茎尖培养脱毒法

1.2.1概述

茎尖培养脱毒算是采取茎尖分生组织离体培养的办法猎取无病毒试管苗，其办法是在解剖镜下，用解剖刀举行迅速准确地茎尖剥离，因为茎尖分生组织基本别带病毒，利用植物茎尖分生组织举行离体培养，再结合病毒检测，就能够获得无病毒的植株。

茎尖培养脱毒法脱毒率高，脱毒速度快，能在较短的时刻内得到较多的原种生殖材料，但这种办法存在的缺点是植物的存活率低。为了克服这一缺点，如今经常是将茎尖培养与热处理相结合来使用。茎尖培养与热处理相结合之因此可以提高脱毒效果，是由于热处理可使植物生长本身所具有的顶端免疫区得以扩大，有利于切取较大的茎尖（1mm左右），从而可以提高培养或嫁接的成活率。

1.2.2原理

茎尖培养脱毒的原理是植物体内病毒靠维管束系统挪移，分生组织中没有维管束存在，病毒只靠胞间连丝挪移，速度非常慢，难以追上生长活跃的分生组织，因此旺盛生长的根尖、茎尖普通都无病毒或非常少有病毒分布。

据研究，植物体内某一部分组织器官别带病毒的缘故是：分生组织的细胞生长速度快，病毒在植物体内生殖的速度相对较慢，而且病毒的传播是靠筛管组织举行转移或经过细胞间连丝传递给其他细胞，所以病毒的传递扩散也受到一定限制，如此便造成植物体的部分组织细胞没

有病毒。依照那个原理，能够利用茎尖培养来哺育无病毒苗木。

1.3抗病毒药剂法

1.3.1概述

抗病毒药剂法，这是一种新的脱毒办法，运用一些抗病药剂的作用妨碍病毒RNA的复制形成，干扰病毒的正常生长，从而达到除去病毒的目的。常用的抗病毒化学药物有三氮唑核苷（病毒唑）5-二氢尿嘧啶，（DHT）和双乙酰-二氢-5-氮尿嘧啶（DA-DHT）。这些药物常常经过直截了当注射到带病毒的植株上，或者加到植株生长的培养基上。这种办法普通要与茎尖培养相结合应用。通过抗病毒药剂处理的嫩茎，切取茎尖，再举行组织培养，就会提高脱毒率和成活率。

1.3.2原理

抗病毒药剂法的作用原理是抗病毒药剂在三磷酸状态下会阻挠病毒RNA帽子结构

形成而达到除去病毒的效果。

2．脱毒效果的检测办法

通过脱毒处理的植株是否还存在病毒，必须通过病毒学检测才干确定。传统上向来沿用的

检测办法是目测法，然而这种办法无法剔除潜隐性病毒。后来浮现的指示植物法，扩大了检测

范围。近年来随着生物科学的迅猛进展，免疫学办法，分子生物学办法等许多先进的理化技术

的应用，促进了病毒检测技术的改进与进展。下面简要介绍几种检测脱毒苗的办法。

2.1植株直截了当测定法

直截了当观看植株茎叶有无某种病毒引起的可见症状，是最简单的测定办法。只是，由于某些

寄主植物感染病毒后需要较长的时刻才浮现症状，有的并别能使寄主植物浮现可见的症状，因

而无法快速检验。

2.2指示植物法

此法利用病毒在其他植物上浮现症状的特征，作为鉴不种类的标准。当原始寄主的症状别

明显时，就可用指示植物法，这是因为指示植物比原始寄主更容易表现症状。具体做法是将病

叶研磨，把汁液接种到寄主植物上，关于木本植物，是将原始寄主嫁接到指示植物上。指示植

物法简便易行，成本低，但它灵敏性差，所需时刻长，难以区分病毒种类。

2.3血清学办法

抗血清鉴定法要举行抗原的制备(包括病毒的生殖，病叶研磨和粗汁液澄清等)，抗血清的

采收、分离等。血清可分装到小玻璃瓶中，贮存在–15~–25℃的冰冻条件下。测定时，把

稀释的抗血清与未知的病毒植物在小试管内混合，这一反应导致形成可见的沉淀，后依照沉淀

反应来鉴定病毒。此法灵敏度高，然此获得检测结果迅速，是目前检测病毒的一种最好办法。此外，PCR微量板杂交法[4]、电子显微镜检定法、病毒症状学诊断法等也可用来检测植物病毒。

3．马铃薯组织培养脱毒快繁技术

鉴于当前农业经济作物生产上苗木（要紧是无性生殖作物）存在着严峻病毒累积、品种退化、产量和品质大幅度的下落等咨询题，探究一种脱毒效果好、生殖系数高、简易且经济的繁育

良种及健苗技术，是当前农业经济作物种苗木生产中急需研究和探讨的课题。下面以马铃薯为例，举行热处理加茎尖培养结合病毒检测法获得脱毒苗的办法，简述植物组织培养脱毒快繁技

术在马铃薯育种中的应用。

3.1研究简史

马铃薯在种植过程中易感染病毒，当条件适合时，就会在植株体内增殖，转运和积存于所

结薯块中，同时世代传递，逐年加重[3]。病毒的增殖与植物正常代谢极为紧密，目前尚没有

发觉既能杀死病毒又别损伤植物的药剂，病毒危害一度成为马铃薯的别治之症。1953年Nirris将孔雀石绿（Malachitegreen）加入培养基中抑制病毒生殖，并经过茎尖组织培养，获得青山（Greenmountain）品种无PVX（马铃薯X病毒）的马铃薯植株。此后，经过茎尖组织培养获

得无病毒植株的技术迅速进展，为解决马铃薯病毒危害提供了有效途径，为生产提供优良种薯。目前，国际上用茎尖培养产生的马铃薯品种已达150个左右[1]。

科学研究结果证明，侵染马铃薯的病毒有20多种。这些病毒一旦侵入马铃薯植株和块茎，就会引起马铃薯退化，浮现各种各样的病态，造成别同程度的减产。研究的结果还证明，病毒在植物组织中分布是别均匀的，同时受一定环境条件妨碍，在靠近马铃薯茎的顶端病毒浓度非常低或别含病毒。依照这一特点，经过茎尖培养能够获得马铃薯无病毒苗[2]。另外，马铃薯病毒，有的对温度比较敏感，有的别敏感，但对植株或发芽的块茎举行高温处理后再作茎尖培养，普通脱毒率都比较高。所以，在茎尖培养前，对植株和发芽块茎举行30~35℃，28天的高温预处理，能收到良好的效果。

3.2马铃薯茎尖培养脱毒办法

利用茎尖组织培养结合病毒检测，对马铃薯举行脱毒，进而生产脱毒种薯用于生产，可有效地防止种薯退化，大幅度提高马铃薯产量。

3.2.1取材和消毒

将欲脱毒地品种块茎催芽，芽长4~5cm时，剪芽并剥去外叶，自来水下冲洗40min，于无菌室内用漂白粉溶液消毒后，无菌水冲洗2~3次。

3.2.2剥离茎尖和接种

在无菌室内，于40倍地解剖镜下，剥取带1个叶原基地茎尖，接种于MS茎尖培养基地试管中。试管中的MS茎尖培养基包括大量元素、微量元素、有机成分和生长素、细胞分裂素、蔗糖和琼脂，pH值为5.8，通过高压蒸汽灭菌后使用，每试管接种1个茎尖。

3.2.3培养基和培养条件

茎尖培养的关键是将脱毒后的茎尖透导生成带有完整根、茎、的植株，所以挑选适合的培养基十分重要。关于马铃薯的茎尖培养来讲，需要较多的NO3ˉ和NH4营养，MS和Miller基本培养基基本上较好的培养基，而且附加少量（01.mol/l~0.5mol/l）的生长素或细胞分裂素或二者都加，培养的效果更好。接种的茎尖培养于25℃、1500~3000LX光照条件下培养室内，3个月则长成3~4片叶的小植株在无菌条件下，举行切段扩繁[2]。

3.2.4病毒检测[5]。

病毒检测是茎尖脱毒别可缺少的步骤。通过脱毒技术得到的脱毒植物必须通过严格的病毒检测，证实真的无毒又具备优良性状后才干作为种苗。常用鉴不寄主即指示植物法或血清学办法举行检测，及时淘汰血清学阳性反应或在指示植物上有症状的茎尖苗，无任何反应的茎尖苗即脱毒苗用作大田快速生殖。

3.2.5结果

经过利用茎尖组织培养结合病毒检测法获得马铃薯脱毒苗，经病毒检测，除去了马铃薯中的病毒病，脱毒率可达100%。

4．植物组织培养脱毒快繁技术应用前景的简述

植物组织培养技术在作物上要紧用于育种和良种生殖，其次用于无性生殖作物的脱毒和快繁以及种质的保存等，可见植物组织培养脱毒快繁技术关于农作物苗木的生产具有极其重要的地位[1]。一些农作物或是花卉植物等因长期的栽培和种植，植物体内被侵染携带病毒、种性退化如今能利用组织培养及快繁脱毒办法开辟出的植物脱毒新品种有马铃薯、甘薯、生姜、大蒜、草莓、罗汉果、棕榈、剑麻、香蕉、甘蔗以及花卉植物等几百种再生植株。目前这种技术已得到了广泛应用，前景及范围很广大。

参考文献[1]．曹孜义刘国民．《有用植物组织培