DB11T 1809-2020实验动物 微生物检测

北京市市场监督管理局发布CSB北京市地DB11方标准DBT20DBT.3—2017，DB11/T1459.4—2018，DB11/T1459.5—2018oryanimalMicrobiologicaltestingIDBT9—2020 DBT9—2020前言GBT件的结构和起草规则》的规定分:实验用狨猴》、DB11/T1459.5—2018《实除结构调整和编辑性改动外，主要技术变a5.2.1，DB11/T1459.1—2017；c.1、7.2，DB11/T家卫生健康委科学技术研中国人民解放军军事科学院军事医动物管理办公室、北京实验动物行北京市标准化研究院。鸣、姚文生、薇、巩薇、遇秀玲、卢胜明、刘云魏强、向志光、佟巍、张丽芳、阮研硕、李长龙、萨晓婴、戴方伟、陈振文、杜小燕。所代替文件的历次版本发布情况为：第一次修订。1DBT9—2020实验动物微生物检测范性引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本GB9.7食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验GB4789.15食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数TTTTT测方法TT方法TBTT菌检测方法T方法T测方法TTT膜炎病毒检测方法T法TT方法TT2DBT9—2020GBT4926.28GBT4926.46GBT4926.47GBT4926.48GBT4926.49GBT4926.56GBT4926.57GBT4926.59GBT4926.60GBT4926.62GBT4926.63GBT4926.64法方法测方法法GBT6551猪瘟诊断技术GBT7999.1测GBT7999.5测GBT7999.6测T离、鉴定及血清中和抗体检测技术T征诊断方法T技术规范T诊断技术T方法T诊断技术T菌检验方法T离鉴定方法TT链反应试验方法TTTTTTTTTGB/T动物狂犬病病毒核酸检测方法3DBT9—2020NY/TNY/TNY/TNY/TNY/TNY/TNY/TNY/TNY/TNY/TNY/TNY/TNY/TNY/TNY/TNY/TNY/TNY/T痢诊断技术集、保存与运输技术规范和试验方法诊断技术性鼻炎诊断技术炎诊断技术品沙门氏菌检测方法术诊断技术巴氏杆菌病)诊断技术痘诊断技术T法检疫技术规范技术规范SNT猪水泡病检疫技术规范SNT鸭病毒性肠炎检疫技术规范SNT水貂阿留申病检疫技术规范4DBT9—2020SNTSNTSNTSNTSNT门螺杆菌的检验方法定义件。toryanimal科学研究、conventional(CV)laboratoryanimal3.2.1级实验动物specificantigen&antibody-freeconventional(CV)specificpathogenfree(SPF)laboratoryanimalgermfreeGFlaboratoryanimal等级分类检测要求5DBT9—2020.1外观检查检实验动物的精神状态、行为、被毛、天然孔分泌物进行外观检查。5.2微生物检测项目实验小型猪各等级病原微生物检测项目us▲▲▲-口蹄疫病毒(Foodandmouthdiseasevirus)▲▲(Classicalswinefevervirus)▲▲征病毒(Highlypathogenicporcinereproductiveandrespiratorysyndromeus●-(Brucella)▲●(Leptospira)○○Erysipelothrixrhusiopathiae)○-征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus)-▲(Pathogenicdermalfungi)-●级us●●●○virus●●猪瘟病毒(Classicalswinefevervirus)●●征病毒(Highlypathogenicporcinereproductiveandrespiratorysyndromeus●-(Brucella)●●(Leptospira)○○Erysipelothrixrhusiopathiae)○-毒(Pseudorabiesvirus)●●s●●(Porcineparvovirus)●●征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus)●●放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniaes)●●体(Mycoplasmahyopneumoniae)●●旋体(Brachyspirahyodysenteriae)●●性胃肠炎病毒(Transmissiblegastroenteritisvirus)●●6DBT9—2020级腹泻病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus)●-波氏杆菌(Bordetellabronchiseptica)○●Pasteurellamultocida○●HaemophilusParasuis)○-(Pathogenicdermalfungi)-●病毒(Swinevesiculardiseasevirus)-○沙门氏菌(Salmonellaspp.)-○命体●●。行。实验羊各等级病原微生物检测项目virus▲▲(Brucella)▲▲Mycobacteriumbovis)●-(Bacillusanthrac)○○(Leptospira)○○体(Borreliaburgderferi)○-laburnetii○○Pestedespetitsruminantsvirus)-▲毒(Sheep/Goatpoxvirus)-▲virus●●(Brucella)●●Mycobacteriumbovisis)●-(Bacillusanthrac)○○(Leptospira)○○体(Borreliaburgderferi)○-laburnetii○○病毒(Bovineviraldiarrheavirus)●-病毒(Infectiousbovinerhinotracheitisvirus)●-(Mycobacteriumparatuberculosis)●●杆菌(Campylobacterfetus)●●Pasteurellamultocida●-(Bovineleukemiavirus)●-7DBT9—2020Chlamydia)●●(Bluetonguevirus)○○牛流行热病毒(Bovineephemeralfevervirus)○-Pestedespetitsruminantsvirus)-●毒(Sheep/Goatpoxvirus)-●毒(Pseudorabiesvirus)-●capricolum-●-●梅迪-维纳斯病毒a(Maedi-visnavirus)-○-○-○命体●●。猴各等级病原微生物检测项目●脉络丛脑膜炎病毒(LymphocyticChoriomeningitisVirus)○沙门氏菌(Salmonellaspp.)●(Pathogenicdermalfungi)●志贺菌(Shigellaspp.)●Mycobacteriumtuberculosis)●●脉络丛脑膜炎病毒(LymphocyticChoriomeningitisVirus)○沙门氏菌(Salmonellaspp.)●(Pathogenicdermalfungi)●志贺菌(Shigellaspp.)●Mycobacteriumtuberculosis)●(Sendaivirus)○病毒(Simianimmunodeficiencyvirus)●●(Simianpoxvirus)●(Yersiniaenterocolitica)●8DBT9—2020各等级病原微生物检测项目(续)ampylobacterjejuni○(Proteusmirabillis)○命体●爪沙鼠各等级病原微生物检测项目(Hantavirus)●脉络丛脑膜炎病毒(LymphocyticChoriomeningitisVirus)●沙门氏菌(Salmonellaspp.)●(Pathogenicdermalfungi)○(Hantavirus)●脉络丛脑膜炎病毒(LymphocyticChoriomeningitisVirus)●沙门氏菌(Salmonellaspp.)●(Pathogenicdermalfungi)○(SendaiVirus)●MouseHepatitisVirus)●PneumoniaVirusofMice)●●MinuteVirusofMice)●Pseudomonasaeruginosa)●体(Tyzzer’sorganism)●支原体(Mycoplasmaspp.)●teurellamultocida●菌(Bordetellabronchiseptica)●asteurellapneumotropica●elicobacterpylori●球菌(Staphylococcusaureus)●链球菌(Streptococcuspnemoniae)●molyticstreptococcus○scheri○伯杆菌(Klebsiellaoxytoca)○(Escherichiacoli)○克雷伯杆菌(Klebsiellapneumoniae)○命体●9DBT9—2020貂各等级病原微生物检测项目沙门氏菌(Salmonellaspp.)●(Pathogenicdermalfungi)●志贺菌(Shigellaspp.)●eutiandiseasevirus●(Caninedistempervirus)▲(Canineparvoviurs)▲(Rabiesvirus)▲沙门氏菌(Salmonellaspp.)●(Pathogenicdermalfungi)●志贺菌(Shigellaspp.)●eutiandiseasevirus●支原体(Mycoplasmaspp.)●olyticstreptococcus●杆菌(Bordetellabronchiseptica)●克雷伯杆菌(Klebsiellapneumoniae)○弯曲杆菌(Campylobacterspp.)○asteurellamultocida○菌(Streptococcuspneumoniae)○菌(Proteusmirabilis)○球菌(Staphylococcusaureus)○Pseudomonasaeruginosa)○●(Caninedistempervirus)●(Canineparvoviurs)●(Rabiesvirus)●(Hantavirus)○命体●必检项，要求阴性；“○”表示需要时检测项目，要求阴性。等级病原微生物检测项目胞减少症病毒(Felinepanleukopeniavirus)▲毒(Felinecalicivirus)▲▲DBT9—2020(Rabiesvirus)▲沙门氏菌(Salmonellaspp.)●(Pathogenicdermalfungi)○胞减少症病毒(Felinepanleukopeniavirus)●毒(Felinecalicivirus)●●(Rabiesvirus)●沙门氏菌(Salmonellaspp.)●(Pathogenicdermalfungi)○缺陷病毒(Felineimmunodeficiencyvirus)●性腹膜炎病毒(Felineinfectiousperitonitisvirus)●状病毒(Felineentericcoronavirus)○病病毒(Felineleukemiavirus)○氏杆菌(Bordetellabronchiseptica)●teurellamultocida●(Yersiniaenterocolitica)○○Chlamydia)○ampylobaceterjejuni○Helicobacter○○命体●必检项，要求阴性；“○”表示需要时检测项目，要求阴性。鸡、实验鸭、实验鹅、实验鸽各等级病原微生物检测项目(AvianInfluenzaVirus)▲▲▲○(NewcastleDiseaseVirus)▲●●●MareksDiseaseVirus)▲---气管炎病毒(InfectionBronchitisVirus)▲---传染性喉气管炎病毒(InfectionLaryngotracheitisVirus▲---rus▲---(AvianReovirus)▲---▲---DBT9—2020FowlPoxVirus)▲---沙门氏菌(Salmonellapullorum)●---Haemophilusparagallinarum)▲---体(Mycoplasmagallisepticum)▲---Duckenteritisvirus-▲●-Pasteurellamultocida-●●○沙门氏菌(Salmonellaspp.)-●●●Chlamydia)-●●●(Gooseparvovirus)--▲-级(AvianInfluenzaVirus)●●●○(NewcastleDiseaseVirus)●●●●MareksDiseaseVirus)●---气管炎病毒(InfectionBronchitisVirus)●---传染性喉气管炎病毒(InfectionLaryngotracheitisVirus●---rus●---(AvianReovirus)●---●○○-FowlPoxVirus)●---沙门氏菌(Salmonellapullorum)●---Haemophilusparagallinarum)●---鸡毒支原体(Mycoplasmagallisepticum)●---病毒(LymphoidLeukosisVirus)●---ulendotheliosisVirus●●●-rus●---病毒(AvianEncephalomyelitisVirus)●---●--○(Aviantuberculosis)●---原体(Mycoplasmasynoviae)●---Pasteurellamultocida○●●○Duckenteritisvirus-●●-沙门氏菌(Salmonellaspp.)-●●●Chlamydia)-●●●-●--Riemerellaanatipestifer)-●●-(Gooseparvovirus)--●-Pigeonpoxvirus)---●命体●●●●DBT9—2020。微生物检测项目杆菌(Mycobacteriummarinum)●(Mycobacteriumchelonae)●杆菌(Mycobacteriumabscessus)●Mycobacteriumhaemophilum●Vibriocholerae)●eromonashydrophila●球菌(Streptococcusiniae)○杆菌(Mycobacteriummarinum)●(Mycobacteriumchelonae)●杆菌(Mycobacteriumabscessus)●Mycobacteriumhaemophilum●Vibriocholerae)●eromonashydrophila●球菌(Streptococcusiniae)○(Flavobacteriumcolummare)●(Aeromonasveronii)●(Aeromonasjandaei)●菌(Mycobacteriumfortuitum)●水霉菌(Saprolegniaspp.)●鳃霉菌(Branchiomycesspp.)●lavobacteriumbranchiophilum○avobacteriumpsychrophilum○荧光假单胞菌(Pseudomonasspp.)○菌(Aeromonassobri)○链球菌a(Streptococcusspp.)○命体●a海豚链球菌之外的链球菌。序部毛发、羽毛或皮屑拭子(或新鲜粪便)DBT9—2020部毛发、羽毛或皮屑拭子(或新鲜粪便)1.2麻醉应根据不同动物种类、采集部位决定是否需要麻醉。需要麻醉时，应考虑不同种类实验动培训并具备相应的能力。釆血以及毛发、皮屑、鼻咽拭子、肛拭子(或新鲜粪便)的采样方法参照NY/T541进行。.1.4需要时可根据临床症状和前期检测结果，进一步采集动物组织或特定样本进行检测。DBT9—2020实验鱼检测程序2.2实验鱼的麻醉应方便于检查、采用和满足动物福利伦理的要求。.2.3需要时可根据临床症状和前期检测结果，进一步采集动物组织或特定样本进行检测。生物学检查和取材生物学检查和取材镜和显微镜检查分离培养鉴定(必要时取水样)DBT9—2020实验猪和实验小型猪病原微生物学检测方法原微生物学检测方法按照表9的规定执行。实验小型猪病原微生物学检测方法GBT638GBT915.7GBT935GBT6551征病毒GBT7517GBT646GBT4926.46NYT566GBT641型GBT674SNT征病毒GBT090菌SNTNY/T1186SNT病毒NYT548NYT544菌NYT546NYT546GBT750SNTGBT926.4NYT550实验牛和实验羊病原微生物学检测方法微生物学检测方法按照表10的规定执行。牛和实验羊病原微生物学检测方法GBT528GBT646GBT7639NYT561GBT4926.46DBT9—2020SNTSNTGBT637GBT981GBT637GBT653GBT530SNTNYT562GBT089NTT543GBT982NYT576GBT641NY/T1468NY/T1244病毒SNTSNTSNT实验狨猴病原微生物学检测方法检测方法按照表11的规定执行。验狨猴病原微生物学检测方法GBT926.1GBT926.4GBT4926.47GBT4926.48GBT926.3GBT4926.49SN/T2552.8GB926.60GB926.23GB926.18GBT4926.62GBT4926.63GBT4926.64a指酶结合物使用酶标记的兔抗狨猴IgG抗体。DBT9—2020实验长爪沙鼠病原微生物学检测方法微生物学检测方法按照表12的规定执行。验长爪沙鼠病原微生物学检测方法GBT926.1GBT926.3GBT926.4GBT926.5GBT926.6GBT926.8GBT4926.10GBT4926.11GBT4926.12菌GBT4926.13GBT4926.14GBT4926.15GBT4926.16GBT4926.17炎病毒GB/T14926.18GB/T14926.19GB/T14926.22GB/T14926.23GBT4926.28GB/T14926.25GB/T14926.24验雪貂病原微生物学检测方法GBT926.1GBT926.4GBT4926.47GBT926.8GBT4926.16GBT926.6菌GBT4926.13GBT4926.49GBT926.5DBT9—2020GBT4926.15SN/T2552.8GBT4926.14GBT4926.17SNTGBT4926.59GBT4926.57GBT4926.56GBT539GB/T14926.19实验猫病原微生物学检测方法检测方法按照表14的规定执行。猫病原微生物学检测方法少症病毒GBT789NYT550GBT926.4毒炎病毒毒菌GBT926.6GBT926.5GBT926.3NYT562SNTGBT4926.16实验鸡、实验鸭、实验鹅、实验鸽病原微生物检测方法DBT9—2020验鸡、实验鸭、实验鹅、实验鸽病原微生物检测方法GBT999.6GBT999.6GBT999.5炎病毒GBT999.6炎病毒GBT999.6病病毒SNTSNTGBT999.6GBT999.5NYT536GBT999.1GBT999.6SNTNY/T1247毒GBT999.6GBT999.6GBT999.5NY/T3072GBT999.6NYT563SNTGBT926.1NYT562SNTSNTNYT560实验鱼病原微生物学检测方法验鱼细菌和真菌检测方法检测方法按照表16的规定执行。菌和真菌检测方法ZIRC)ZIRC)ZIRC)培养(GB4789.7)DBT9—2020)培养(GB/T14926.15)离培养(GB/T14926.15及GB/T14926.16)培养(SC/T7201.3)培养(SC/T7201.2)培养(SC/T7201.2)培养(SC/T7201.2)培养(SC/T7201.4)养(GB/T18652)养(GB/T18652)ZIRC)ZIRC)养(GB4789.15)培养(SN/T2439)养(GB/T18652)M.Westerfield)检测规则检测频率应检测1次。8.2抽样.1抽样方式生虫采样要求联合取样，随机抽样。抽样月龄按表17的规定执行。抽样月龄DBT9—2020内随机抽样。2抽样方法按照NY/T541的规定进行。3抽样数量验鱼抽样数量：同一水环境实验鱼数量少于100尾，则抽样5尾；大于等于100尾，则按5%比例抽样量为30尾。其他动物抽样数量按表18的规定执行。抽样数量(只/头/羽)(只/头/羽)100~500送检要求9结果判定9.1抗体检查项目的群体免疫合格率不低于70%，判为合格。疫项目，血清抗体阴性判为合格。9.2抗原和核酸检查阳性结果判为合格。DBT9—2020按照检测规则，检测指标均合格，依据表1~表8，判为符合相应等级的实验动物。按照检测规则，若检测指标有1项(含)以上不合格，依据表1~表8，判为不符合相应等级的实验出具检测报告。DBT9—2020A(规范性)A1待测样本DNA的提取与保存A.2对照设立设置阳性对照、阴性对照。应阶段设置。以灭菌双蒸水作为模板设置空白对照。A3PCR反应引物vp基因序列(GenBank：AF015223)设计：(5′-3′)：AGTTCAACAAGATAAAAGAC′)：TCCTGTATCTTGATGTGCTAA.4PCR反应体系及条件A4.1PCR反应体系LPCRbufferMgLdNTPmM)1.6µL，上下游引物(10µM)各LTaqULLDNAµL，最后用灭菌双蒸水补至20µL。A4.2PCR反应条件A.5PCR产物大小pA.6结果判定阳性对照出现301bp的目的片段，阴性对照无条带，实验成立；待检样品出现301bp目的片段时，判定猫泛白细胞减少症病毒阳性；未出现301bp目的片段时，判定猫泛白细胞减少症病毒阴性。DBT9—2020(规范性)B测样本RNA的提取与保存B立设置阳性对照、阴性对照。应阶段设置。以灭菌双蒸水作为模板设置空白对照。B转录体系U/µL)0.5µL，模板RNA8µL，最后用灭菌双蒸水补至25µL。B转录反应条件BPCR引物及探针基因序列(GenBank：AY560117)设计：5′-3′)：AACCTGCGCTAACGTGCTT：CAGTGACAATACACCCAGAABPCR体系及条件BPCR反应体系25µL体系包括10×PCRbuffer(含Mg2+)2.5µL，dNTP(2.5mM)2.5µL，上下游引物(10µM)LTaq(5U/µL)1.0µL，模板cDNA2µL，最后用灭菌双蒸水补至25µL。BPCR反应条件DBT9—2020BPCR大小B定阳性对照出现926bp的目的片段，阴性对照无条带，实验成立；待检样品出现926bp目的片段时，判定猫杯状病毒阳性；未出现926bp目的片段时，判定猫杯状病毒阴性。DBT9—2020(规范性)C测样本DNA的提取与保存C照设立设置阳性对照、阴性对照。应阶段设置。以灭菌双蒸水作为模板设置空白对照。CPCR应引物tk基因序列(GenBank：FJ478159)设计：5′-3′)：ATACTGTCCGCATTTACATAGA：CGGTTCTTGAGCGTCCCCPCR反应体系及条件CPCR反应体系LPCRbufferMgLdNTPmM)1.6µL，上下游引物(10µM)各LTaqULLDNAµL，最后用灭菌双蒸水补至20µL。CPCR反应条件CPCR产物大小C结果判定阳性对照出现531bp的目的片段，阴性对照无条带，实验成立；待检样品出现531bp目的片段时，判定猫疱疹病毒I型阳性；未出现531bp目的片段时，判定猫疱疹病毒I型阴性。DBT9—2020(规范性)D本RNA的提取与保存D立设置阳性对照、阴性对照。应阶段设置。以灭菌双蒸水作为模板设置空白对照。D逆转录D转录体系U/µL)0.5µL，模板RNA8µL，最后用灭菌双蒸水补至25µL。D转录反应条件DPCR反应引物及探针5′-3′)：AGAACCTGGTGATATACCAGAGAC：TTGGGTCAAGTGCTACATATTGDPCR反应体系及条件D光PCR反应体系50µL体系包括2×Mixbuffer25µL，上下游引物(10µM)各2.5µL，探针(10µM)0.5µL，模板cDNAµL，最后用灭菌双蒸水补至50µL。D光PCR反应条件DBT9—202095C预变性3min；95C30s，64C30s，共5个循环；85C30s，64C1min(采集荧光信号)，循环。D果判定DBT9—2020E(规范性)ERNA取与保存设置阳性对照、阴性对照。应阶段设置。以灭菌双蒸水作为模板设置空白对照。E录E体系U/µL)0.5µL，模板RNA8µL，最后用灭菌双蒸水补至25µL。E反应条件EPCR探针UTR基因序列(GenBank：NC_002306)设计：-3′)：GGCAACCCGATGTTTAAAACTGG：CACTAGATCCAGACGTTAGCTCEPCR条件EPCR25µL体系包括10×PCRbuffer(含Mg2+)2.5µL，dNTP(2.5mM)2.5µL，上下游引物(10µM)LTaq(5U/µL)1.0µL，模板cDNA2µL，最后用灭菌双蒸水补至25µL。EPCRDBT9—2020PCR3bp。E阳性对照出现223bp的目的片段，阴性对照无条带，实验成立；待检样品出现223bp目的片段时，判定猫传染性腹膜炎病毒阳性；未出现223bp目的片段时，判定猫传染性腹膜炎病毒阴性。DBT9—2020(规范性)FRNA的提取与保存F立设置阳性对照、阴性对照。应阶段设置。以灭菌双蒸水作为模板设置空白对照。F逆转录F转录体系U/µL)0.5µL，模板RNA8µL，最后用灭菌双蒸水补至25µL。F转录反应条件FPCR物及探针S列(GenBank：X80799)设计：(5′-3′)：TGCTATTAGTAAGTGGGGCCFPCR系及条件FPCR体系0µL体系包括10×PCRbuffer(含Mg2+)5.0µL，dNTP(2.5mM)1.0µL，上下游引物(50µM)LTaqULLcDNAL灭菌双蒸水补至50µL。FPCR条件DBT9—2020FPCR小pF判定阳性对照出现366bp的目的片段，阴性对照无条带，实验成立；待检样品出现366bp目的片段时，判定猫肠道冠状病毒阳性；未出现366bp目的片段时，判定猫肠道冠状病毒阴性。DBT9—2020(规范性)G测样本RNA的提取与保存G照设立设置阳性对照、阴性对照。应阶段设置。以灭菌双蒸水作为模板设置空白对照。G逆转录G逆转录体系U/µL)0.5µL，模板RNA8µL，最后用灭菌双蒸水补至25µL。G逆转录反应条件G荧光PCR反应引物及探针AACAG荧光PCR反应体系及条件G荧光PCR反应体系20µL体系包括2×Mixbuffer10µL，上下游引物(10µM)各0.4µL，探针(10µM)0.2µL，模板cDNALµL。G荧光PCR反应条件50C2min；95C预变性10min；95C15s，60C1min(采集荧光信号)，共40个循环。DBT9—2020G结果判定G结果判定CtCtDBT9—2020(规范性)H本DNA的提取与保存H立设置阳性对照、阴性对照。应阶段设置。以灭菌双蒸水作为模板设置空白对照。HPCR引物及探针FAMCACCTTCGCTTTTCTGNFQHPCR反应体系及条件H光PC