分子生物学实验

分子生物学实验第一页，共十四页，2022年，8月28日基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交(包括RFLP)及PCR分离基因等。

利用基因组DNA较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中,可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部,从而达到提取的目的。

在提取过程中,染色体会发生机械断裂,产生大小不同的片段,因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作,如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓,以保证得到较长的DNA。一般来说,构建基因组文库,初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析,DNA长度可短至50kb,在该长度以上,可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下),并可保证包含PCR所扩增的片段(一般2kb以下)。第二页，共十四页，2022年，8月28日不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同;不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法,以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时,应考虑除去多糖和酚类物质。本实验以动物肝脏为材料,学习基因组DNA提取的一般方法。第三页，共十四页，2022年，8月28日提纯的思路基因组DNA的特性：分子量较大、易断（如何保证DNA分子的完整性？）2.组织和细胞的破碎3.要去除的物质：蛋白、多糖、脂类、RNA和小分子物质

第四页，共十四页，2022年，8月28日一、材料

哺乳动物新鲜组织。二、设备移液管高速冷冻离心机台式离心机水浴锅。第五页，共十四页，2022年，8月28日三、试剂：1.组织匀浆液200mL灭菌备用

10mmol/LTris-HClpH8.025mmol/LEDTA100mmol/LNaCl2.酶解液100mL（灭菌后再加蛋白酶K和SDS)20mmol/LTris-HClpH8.050mmol/LEDTA200mmol/LNaCl200ug/mL蛋白酶K1％SDS第六页，共十四页，2022年，8月28日3.生理盐水(0.7%)1000mL灭菌备用4.3mol/LNaAcpH5.2100mL灭菌备用先用50mL水溶解固体NaAc再用3mol/L乙酸调pH至5.2，最后定容同时灭菌备用：枪头：1mL、200uL各一盒小指管:2.0、0.5mL各20个研磨棒:20支无菌水：250mlX2瓶第七页，共十四页，2022年，8月28日四、实验步骤

基因组DNA的提取：0.2g鼠肝，冰冷生理盐水洗3次，剪碎加入液氮，研磨碎鼠肝成粉末，加入2mL匀浆液混匀匀浆液转入2mL小指管，40C,5000rpm离心2min,沉淀加0.4mL无菌水，吹散，再加0.4mL酶解液，慢慢颠倒混匀550C水浴酶解过夜或2小时以上，40C存放第八页，共十四页，2022年，8月28日（加RNase,终浓度200ug/mL，370C保温60min）加等体积酚/氯仿/异戊醇，慢慢颠倒混匀，冰上平倒静置10-20min40C，10000rpm离心10min，用扩口枪头取出上清上清加等体积氯仿/异戊醇，慢慢颠倒混匀40C,10000rpm，用扩口枪头取上清第九页，共十四页，2022年，8月28日上清加1/10体积的NaAc和加2倍体积的无水乙醇慢慢混匀沉淀DNA，-200C静置30min，DNA沉淀形成白色絮状物。

12000rpm离心15min，弃上清沉淀用1mL75%冷乙醇洗两次，每次12000rpm离心10min，弃上清超净台中干燥加50uLTE,40C溶解过夜，-200C保存第十页，共十四页，2022年，8月28日基因组DNA的检测前述方法得到的DNA一般可以用作Southern,RFLP、PCR等分析。由于所用材料的不同,得到的DNA产量及质量均不同,有时DNA中含有酚类和多糖类物质,会影响酶切和PCR的效果。所以获得基因组DNA后,均需检测DNA的产量和质量。

1.DNA溶液稀释20-30倍后,测定OD260/OD280比值,明确DNA的含量和质量。(☆)

2.取2-5μl在0.7%agarose胶上80V电泳,检测DNA的分子大小。(☆)

3.取2μgDNA,用10单位(U)HindⅢ酶切过夜,0.7%agarose胶上电泳,检测能否完全酶解(做RFLP,DNA必须完全酶解)。第十一页，共十四页，2022年，8月28日如果DNA中所含杂质多,不能完全酶切,或小分子DNA多,影响接续的分析和操作,可以用下列方法处理：（1）选用幼嫩植物组织，可减少淀粉类的含量。（2）酚:氯仿抽提,去除蛋白质和多糖。（3）Sepharose柱过滤,去除酚类、多糖和小分子DNA。（4）CsCl梯度离心,去除杂质,分离大片段DNA(可用作文库构建)。第十二页，共十四页，2022年，8月28日可能的结果：由于基因组DNA比较难溶、且容易被降解，电泳时经常会出现弥散的或不均一的条带（如左图）。所以实验时一定要注意机械