体外评价体系介绍课件

化妆品检验中心体外评价体系简介体外评价体外评价是指在活生物体之外的环境中利用细胞、模拟活生物体模型等平台进行的评价。在生物评价领域中，体外评价具有以下方面的特点1、符合“3Rs”原则（Reduction，Refinement、Replacement）2、检测结果的稳定性好、再现性高3、可为临床评价提供有效的技术支持体外评价体系的构成评价项目的确立1评价内容的分析2评价方案的建立3最佳评价平台及方法的筛选4安全性评价5功效性评价6评价结果74、光毒性评价（UV照射）对经过被检物质处理过的BALB/c3T3小鼠成纤维细胞进行UVA照射后，以细胞摄取中性红为指标测算出细胞存活率，确定50%细胞毒性的被检物质浓度（TC50）。通过UVA（+）、UVA（-）照射时的TC50应用下列公式计算出PIF值（PhotoIrritantFactor）、MPE值可对被检物质的光毒性潜能进行评价。可以对单一成分和成品进行评价。UVA(-)UVA(+)样品浓度增加细胞生存率降低1、抗氧化应激作用评价氧化应激（OxidativeStress，OS）是指破坏了强氧化剂和抗氧化剂的平衡导致的潜在伤害，氧化剂、抗氧化剂平衡的破坏是细胞损伤的主要原因。皮肤作为机体最外层的保护层，不可避免的受到紫外线与刺激物的作用，使皮肤细胞内的活性氧（ReactiveOxygenSpecies,ROS）过多增加，诱发氧化应激作用，成为引起人体细胞老化的潜在因素。功效性评价项目人体皮肤细胞中氧化应激作用的形成原因①紫外线照射（UVA、UVB）②过多活性氧的累计（•

OH、O2-•、H2O2、1O2

）③过氧化脂质（氧自由基与多聚不饱和脂肪酸反应的产物）抗氧化应激作用的评价评价方法：对细胞进行氧化应激刺激，添加被检物质，通过对细胞生存率的分析来评估被检物质对氧化应激作用的预防与治疗作用。评价项目：评价消除由下列因素诱发的氧化应激作用的效果①UVA、UVB照射②抗活性氧（•

OH、O2-•、H2O2、1O2

）③过氧化脂质评价平台：正常人体表皮角质形成细胞正常人体皮肤成纤维细胞被检物质添加时间点：氧化应激刺激前氧化应激刺激中氧化应激刺激后角质形成细胞成纤维细胞①促进胶原蛋白合成作用评价表皮基底层真皮皮肤基底层附近胶原蛋白示意图4型胶原蛋白7型胶原蛋白1型胶原蛋白1型胶原蛋白：存在于真皮的细胞外基质中，形成三股螺旋结构4型胶原蛋白：多数存在于真皮与表皮之间的基底层中，起到支撑基底层结构的作用7型胶原蛋白：以环状结构与基底层相连接，维持真皮基质的结构对被检物质是否能提高人体皮肤成纤维细胞的1型胶原蛋白合成作用进行评价。伴随年龄的增加及外界环境的影响，皮肤内的1型胶原蛋白含量会减少，从而形成皱纹和皮肤松弛。本评价项目，通过向人体皮肤成纤维细胞添加被检物质后，测定细胞内1型胶原蛋白合成量（ELISA法），根据结果评定被检物质是否具有促进胶原蛋白合成的作用。②胶原酶活性阻碍作用胶原酶是一种能水解胶原蛋白的三维螺旋结构的分解酶。体内胶原酶会随年龄的增加以及外界环境的作用下，促进其活性的增加，从而加速其对胶原蛋白的分解，破坏皮肤结构，出现皱纹、皮肤松弛等皮肤衰老迹象。让胶原酶与添加了被检物质的胶原蛋白反应，测定胶原蛋白的分解程度，通过实验结果分析被检物质是否具有阻碍胶原酶活性增加的作用，评估被检物质的衰老作用。③弹性蛋白酶阻碍作用弹性蛋白酶作用是分解维持肌肤张力的弹性蛋白。随着年龄增加、过多活性氧的堆积促进弹性蛋白酶分解弹性蛋白，是形成皮肤衰老的因素之一。因此，阻碍弹性蛋白酶活性，可恢复肌肤张力，起到抗衰老的作用。让弹性蛋白酶与添加了被检物质的弹性蛋白反应，测定弹性蛋白的分解程度，通过实验结果分析被检物质是否具有阻碍弹性蛋白酶活性增加的作用，评估被检物质的衰老作用。④促进玻尿酸合成作用评价玻尿酸是一种高分子的多醣体，是由葡萄醛酸-N-乙酸氨基葡萄糖为双糖分子单位组成的直链高分子多醣，平均分子量介于10万到1000万Dalton之间，存在于人体皮肤组织中，填充在细胞与胶原纤维的空间中。具有保持皮肤弹性功能，锁住大量水分子，对组织具有保湿润滑作用，使肌肤饱满年轻有弹性。但随着老化及年龄的增长，玻尿酸流失速度比生长速度快时，肌肤也逐渐变得缺乏水分，失去光泽弹性，出现皱纹等老化现象。本评价项目，通过向人体皮肤成纤维细胞或人体表皮角质形成细胞添加被检物质后，测定细胞内玻尿酸合成量（ELISA法），根据结果评定被检物质是否具有促进玻尿酸合成的作用。①黑色素生成抑制作用黑色素细胞受到紫外线照射后，启动人体保护机制生成黑色素，黑色素吸收紫外线的作用避免皮肤细胞受到损伤。但持续的照射促进了黑色素细胞活性，导致生成了过量的黑色素，从而在皮肤上形成了色素沉淀与色斑。因此，化妆品成分、产品的黑色素生成抑制作用是评价其美白功效的重要参数之一。本评价项目，将被检验物质添加到黑色素瘤细胞培养，测定黑色素瘤细胞生成的黑色素含量，分析其抑制黑色素生成的能力，评估其美白作用的功效。评价平台：B16BL6小鼠黑色素瘤细胞样品处理后黑色素生成效果样品浓度小大黑色素抑制效果小大②酪氨酸酶活性阻碍作用酪氨酸酶（Tyrosinase）是黑色素合成的关键酶。对酪氨酸酶活性进行阻碍可抑制黑色素的生成。本评价项目将被检物质与标准物质进行酪氨酸酶活性阻碍效果对比，以及被检物质浓度与阻碍效果关系的分析。黑色素形成途径以及酪氨酸酶活性作用③黑色素分解作用维生素C的黑色素分解效果实验操作示意图持续受到刺激的黑色素细胞会生成过多的黑色素，形成色斑与色素沉淀。具有黑色素分解作用的美白化妆品可淡化由黑色素引起的色斑，缓解色素的沉淀。本评价项目，通过酪氨酸酶的酶作用将酪氨酸合成为黑色素，然后添加被检物质测定其黑色素分解效果，根据结果对其黑色素分解能力进行评估。②COMETAssay（彗星测定）COMETAssay（彗星测定）也称为单细胞凝胶电泳测定技术，它是一种敏感单链或双链DNA突变和破损的遗传测定方法。

DNA发生解螺旋，损伤的DNA断链及片段被释放出来，由于这些DNA的分子量很小，所以在电泳过程中会离开核DNA向阳极移动，形成彗星状的图像，而未损伤的DNA部分保持球形。DNA受损越严重，产生的断片越多并且片段越小，电泳时迁移的DNA量也就越大，迁移距离越长，荧光显微镜下可观察到尾长增加、尾部荧光强度增强。可用于DNA损伤预防及修复作用的评价。UVB照射后样品COMETAssay结果三维仿真皮肤组织模型三维仿真皮肤是由正常人体成纤维细胞与人体角朊