郜刚分子生物学-10-4-基因克隆技术

本节点了解5.4基因克隆的概念5.4.1RACE5.4.2RDA5.4.3Gateway大规模克隆5.4.4Map-basedcloning5.4.5tail-PCR5.1.1克隆与克隆热克隆的现代含义基因克隆基因克隆策略基因克隆相关技术SeverinoAntinori

PanosZavos

塞维里诺·安蒂诺里帕纳奥斯·扎沃斯意大利男性不育症专家美国肯塔基大学生殖生理学家

2001年3月1997年2月，英国罗斯林研究所wilmut等（见Nature

385,810–813;1997）克隆的第一次发热实际上是在1997年克隆羊Dolly(1997-2003)2001年1月2000年8月克隆鼠、克隆牛、克隆猪等相继问世含有黄色荧光基因（水母）的克隆小猪美国密苏里大学2001年10月颜色美国邪教组织

“雷利安运动”

铁了心的要克隆人

左图为冒死也要克隆人布瓦瑟利耶

2001年7月2000年9月克隆技术伊拉克总统萨达姆

准备克隆100个小萨达姆狂人政客

美国先进细胞科技公司

（AdvancedCellTechnology

Ltd）

2001年11月25日世界首例人类克隆胚胎该公司发言人韦斯特

克隆技术美国马萨诸塞州的生物技术公司主流科学家的伪科学(1)：韩国“克隆之父”黄禹锡教授的造假2005年刊载于《科学》杂志上的黄禹锡（韩国首尔大学）论文数据属于故意伪造：没有证据表明黄禹锡曾利用患者体细胞克隆出任何胚胎干细胞，论文数据属于故意伪造，克隆的11个干细胞至少有9个是伪造的，另外两个也和病人细胞不匹配浙江大学论文造假风波……中国工程院院士李连达博士后贺海波踏实为学诚信为人坚守道德守住底线

Dolly克隆技术克隆技术Clone翻译过来克隆“Clone”起源于希腊文“Klone”，原意：用“嫩枝”或“插条”繁殖。最初意义无性繁殖现代意义

两个词性、三层含义动词，通过某种操作比如显微操作、分子生物学操作来获得与某种祖先相同的分子、细胞、个体的过程。名词，通过上述操作获得的遗传上与祖先相同的分子、细胞、个体。克隆技术媒体意义抄袭作弊造假

当作名词时，克隆是指由遗传组成完全相同的分子、细胞或个体组成的一个群体。例如，

DNA分子克隆或基因克隆是指核苷酸序列相同的一群DNA分子或基因拷贝；细胞克隆则是来源于同一祖细胞的、基因型完全相同的一群子细胞；个体克隆则是指基因型相同的个体的拷贝。

克隆技术

当作动词是指运用DNA重组技术将一个特定的基因或DNA序列输入一个载体分子；也指分离出单个分子、基因、细胞或个体后，使之增殖成一个群体的一系列实验操作。克隆技术分子生物学中特指基因克隆（genecloning）

指的是从基因组中把某个基因分离出来，再把它重组在合适的载体上，使之增殖成许多拷贝的过程。

1、基因的序列如何；2、染色体上，位置关系如何；3、放置在合适的载体上。克隆技术

基因克隆的一般策略已知基因的序列已知基因的DNA全部或部分DNA序列（功能可能已知）已知其它物种的同类基因的DNA序列（功能可能已知）已知目的基因cDNA全部或部分序列已知目的基因表达产物蛋白等序列一般采用PCR技术或探针分子杂交技术已有基因图位或标记、转座子等未知基因的序列用转座子标签法、T-DNA标签法及图位克隆技术随机引物多态性扩增技术，定向引物扩增技术和DDRT-PCR、SSH-PCR、RAP-PCR、DNA-RDA、cDNA捕捉法差异筛选法、差减杂交（SH）、mRNA差别显示技术（DDRT-PCR）、代表性差异分析（RAD）、抑制型差减杂交（SSH）有差异表达的目的基因无差异表达的目的基因目的基因表达具有组织、器官等时空差异性文库筛选法、功能蛋白分离法即直接测序等进行，是难度较大较繁琐的策略表型克隆策略目的基因定位克隆策略反向遗传学侯选定位克隆策略功能克隆策略Newtechnology???1已知序列基因的克隆概述：对已知序列的基因克隆是基因克隆方法中最为简便的一种。获取基因序列多从文献中查取,即将别人报道的基因序列直接作为自己克隆的依据。现在国际上公开发行的杂志一般都不登载整个基因序列,而要求作者在投稿之前将文章中所涉及的基因序列在基因库中注册,拟发表的文章中仅提供该基因在基因库中的注册号(accession

number),以便别人参考和查询补充：已知序列克隆1/4已知序列的来源目前,世界上主要的基因库有: (1)EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室的基因库,其网上地址为http://www.ebi.ac.uk/ebi-home.html; (2)Genbank,为设在美国国家卫生研究院(NIH)的基因库,其网上地址为http://www.ncbi./web/search/index.html; (3)Swissport和TREMBL, Swissport是一蛋白质序列库,其所含序列的准确度比较高,而TREMBL只含有从EMBL库中翻译过来的序列。补充：已知序列克隆2/4目前,以Genbank的应用最频繁。免费查询基因序列设计特异的引物,通过PCR从基因组中克隆该基因，也可以通过RT-PCR克隆cDNA。补充：已知序列克隆3/4

这是基因克隆的一种较直接的方法。

值得注意的是,由于物种和分离株之间的差异,为了保证PCR扩增的准确性,有必要采用两步扩增法,即nestedPCR。补充：已知序列克隆4/42表型或功能克隆（了解）1、定义表型克隆（phenotypiccloning）或者称为功能克隆（functionalcloning）、差异基因克隆。从功能出发，利用特定组织细胞器官与正常组织细胞器官DNA或RNA水平上的差异，进行相关基因的分离与克隆，这些基因表达变化是与可检测的表型变化直接联系的，故称为表型克隆，这些表型变化又是与某种生理功能紧密相关的，所以又称为功能克隆。补充：功能克隆1/4抗病与不抗病的表型产物已知基因的功能克隆方法

（适用于产物和功能已知的基因）具体作法在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或基因组文库,DNA文库中基因的筛选根据情况主要可用二种办法进行

(1)将纯化的蛋白质进行氨基酸测序,据此合成寡核苷酸探针从cDNA库或基因组文库中筛选编码基因,(2)将相应的编码蛋白制成相应抗体探针,从cDNA入载体表达库中筛选相应克隆。 功能克隆是一种经典的基因克隆策略,很多基因的分离利用这种策略。克隆技术

功能克隆

氨基酸序列核苷酸序列PCR特异蛋白质目的基因

抗体

基因文库筛选寻找表型异常找出导致表型异常的异常功能蛋白质根据氨基酸序列推导DNA序列以此为探针筛查基因文库或cDNA文库克隆这种异常蛋白质的编码基因2/4补充：功能克隆2/4（了解）评价

优点--

在单基因性状的基因分离方面仍为常用策略

缺点--

特异蛋白质确定、鉴定及其纯化困难

--难以分离微量表达基因

--无法研究无蛋白质产物的基因

--难以进行多基因控制性状的基因分离

3/4补充：功能克隆3/4（了解）产物序列未知基因的功能克隆方法（适用于功能已知、产物未知的基因）mRNA差异展示（mRNAdifferentialdisplay,DDRT-PCR）代表性差示分析（representationaldifferenceanalysis,RDA）抑制性差减杂交（suppressionsubtractivehybridization,SSH）差异消减展示（differentialsubtractiondisplay,DSD）补充：功能克隆4/4page1845.4.1RACE技术

(rapid-amplificationof

cDNAends)5’RACE3’RACEclassicRACETheSMARTRACE:SwitchingMechanismAt5'endofRNATranscript.

TheTakalaRACEp183RACE重点了解其原理了解其主要的操作步骤RACE

(rapid-amplificationof

cDNAends)是Frohman等

20世纪80年代发展起来的cDNA末端克隆技术。通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术。经典的RACE主要通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的cDNA5′和3′端，包括单边PCR和锚定PCR。完整的cDNA序列可以通过文库的筛选和末端克隆技术获得。RACE经典的RACE特点：从一个相同的cDNA模板进行5’和3’末端快速克隆的方法。首要条件：至少获得mRNA的23－28个核苷酸序列信息，以此来设计5’末端和3’末端RACE反应的基因特异性引物（genespecificprimer，GSP）步骤多、时间长、特异性差RACE克隆目标cDNA全长

3种情况，3种策略aaaaa5’aaaaa目标A段已知或C段已知或B段已知策略13’RACE已知5’扩3’5’策略25’RACE已知3’扩5’策略35’RACE和3’RACERACE5’RACE(通常用于已知3’求5’)5’AAAAAAAA3’CCCCCC5’3’5’AAAAAAAA3’mRNAcDNA第一链GSP1→→GGGGaaaaaGSP2详细文字见page191注意书中有错误第2步应该为RNaseH；第4步应该是oligodG做锚定引物1利用已知基因片段，设计基因特异的引物GSP1，在反转录酶的作用下，合成cDNA第一链；2用RNAaseH降解杂合链中的mRNA，3末端转移酶在第一链cDNA3’端增加oligodC，4针对oligodC设计锚定引物AP，以第一链cDNA为模板扩增出5‘端AP3’RACE(通常用于已知5’求3’)5’AAAAAAAA3’TTTTTTTT5’5’AAAAAAAA3’mRNAcDNA第一链GSP1TTTTTTTT1利用已知基因片段3’末端的polyA，设计锚定引物oligodT（引物3‘端增加两个兼并引物），在反转录酶的作用下，合成cDNA第一链；2用RNAaseH降解杂合链中的mRNA，3利用基因特异的引物GSP和锚定引物进行PCRAPRACE方法的改进对传统RACE技术的改进主要是引物设计及RT-PCR技术的改进1、利用锁定引物(lockdockingprimer)合成第一链cDNA，即在oligo(dT)引物的3’端引入两个简并的核苷酸[5’-Oligo(dT)16-30MN-3’，M=A/G/C；N=A/G/C/T]，使引物定位在poly(A)尾的起始点，从而消除了在合成第一条cDNA链时oligo(dT)与poly(A)尾的任何部位的结合所带来的影响；补充：RACE（了解）2、在5’端加尾时，采用poly(C)，而不是poly(A)3、采用RNaseH-MMLV（莫洛尼氏鼠白血病毒反转录酶）或选择嗜热DNA聚合酶可能在高温（60度-70度）有效地逆转录mRNA，从而消除了5’端由于高CC含量导致的mRNA二级结构对逆转录的影响4、采用热启动PCR(hotstartPCR)技术和降落PCR(touchdownPCR)提高PCR反应的特异性RACE方法的改进补充：

RACE（了解）商业化RACE技术产品CLONTECH的SMARTRACE技术TAKALA的fullRACE技术BioGene的CapFishingTM

技术补充：

RACE（了解）

SMART™RACEcDNAAmplificationKit

补充：

RACE（了解）补充：

RACE（了解）SMART™RACE技术smart在什么地方？不同反转录酶合成的cDNA3’端具有不同的保真度和不同的加尾特性，MMLV可以在cDNA末端特异地加上3-4个甚至更多个dCTP。SMART™RACE技术就是利用MMLV的这一特性合成cDNA第一链，同时利用它的加尾特性在合成的cDNA链3’加上3-4个dCTP，而且当帽子结构存在时该酶的加尾活性变得最高，这就起到了对全长分子的富集的作用SwitchingMechanismAt5'endofRNATranscript.

补充：

RACE（了解）SMARTTM5’-RACE的原理是先是利用mRNA的3’末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以Oligo(dT)30MN作为锁定引物。在反转录酶MMLV作用下合成标准第一链cDNA。利用该反转录酶的末端转移酶活性，在第一链的5’末端自动加上3-5个dC，退火后dC与含有Oliogo(dG)通用接头引物配对后，第一链转换为模板。接头上带有通用引物UPM(universalprimer,UPM)的结合位点，UPM作为上游引物，用一个基因特异引物2(genespecificprimer,GSP2)作为下游引物，扩增出第二链补充：

SMARTRACE5’First-strandsynthesisisprimedusingamodifiedoligo(dT)primer.AfterreversetranscriptasereachestheendofthemRNAtemplate,itaddsseveraldCresidues.TheSMARTIIAOligonucleotideannealstothetailofthecDNAandservesasanextendedtemplateforPowerScriptRTpolymerase.MechanismofSMART™cDNAsynthesis（了解）补充：End-to-EndPCR

and

Ligationof5'-and3'-RACEFragments

End-to-EndPCR

Ifyouknowtheextremesequencesofthe5'-and3'-endsofyourtargetcDNA,youcanusethesequencestodesign5'and3'primersforthegenerationofyourtargetfull-lengthcDNA.Theextremesequencesofthe5'-and3'-endscanbeobtainedfromthe5'-and3'-RACEproductsofyourgenethatisgeneratedbythiskitasdescribedintheSections5and6.Ifyouknowthesequenceatthe5'and3'endsofatargetcDNA,youcansynthesize5'and3'primersandperformPCRusingthem.Ligationof5'-and3'-RACEFragments

IfyouknowauniquerestrictionenzymesiteinyourtargetcDNA,youcanusetherestrictionsitetogeneratethefull-lengthtargetcDNA.First,youcangenerate5'-and3'-RACEproductsofyourtargetcDNAthatshouldhavetheoverlappingregionbetweenthem.Theuniquerestrictionsiteshouldbepresentwithintheoverlappingregion.Second,the5'-and3'-RACEfragmentsaredigestedbytheuniquerestrictionenzymeandthedigested5'-and3'-RACEfragmentsareligatedtogeneratefull-lengthcDNARACE（了解）补充：TaKaRa5‘-FullRACE技术TaKaRa5’-FullRACEKit应用了“去帽法”原理：用烟草酸焦磷酸酶(TobaccoAcidPyrophosphatase，TAP)去掉mRNA的5‘帽子结构，加上一个Adaptor，然后使用5'Adaptor上的引物与已知序列部分的引物GSP进行RT-PCR反应，高特异性地扩增cDNA5'末端的全长序列。RACE（了解）补充：TaKaRa5’-FullRACEAlkalinePhosphatase(CIAP)对TotalRNA中裸露的5'磷酸基团进行去磷酸反应使用TobaccoAcidPyrophosphatase(TAP)去掉mRNA的5'帽子结构，保留一个磷酸基团（了解）补充：TaKaRa5’-FullRACEKit

试剂盒具有以下特点：1.扩增cDNA的5‘末端全长序列：应用了“去帽法”原理，可以有效扩增cDNA的5'末端全长序列。2.高灵敏度：采用了套式PCR法，对低丰度的基因或极少量的RNA样品同样可以进行5'RACE实验。3.高特异性：套式PCR法的使用，大大提高了5'RACEDNA片段扩增的特异性。4.长片段5‘RACE扩增：试剂盒中使用了本公司特殊改良的M-MLV(RNaseH-)反转录酶，反转录性能良好，使长片段的RT-PCR扩增成为了可能。5.麻烦，没有富集作用（了解）补充：反应中涉及到的一些事项cDNA的合成起始于polyA+RNA。如果使用其它的基因组DNA或总RNA，背景会很高。RACEPCR的效率还取决于总的mRNA中目的mRNA的量和不同的引物有不同的退火和延伸温度。在进行5‘和3’RACEPCR的时候应该使用热启动。（了解）补充：RACE引物的设计：基因特异性引物（GSPs）应该是：

23－28nt50－70％GCTm值≥65度，Tm值≥70度可以获得好的结果需要实验者根据已有的基因序列设计5‘和3‘RACE反应的基因特异性引物（GSP1和GSP2).由于两个引物的存在，PCR的产物是特异性的。（了解）补充：如果要用重叠片段来检测设计的引物，GSp1和GSp2之间至少是100－200碱基。只有这样才可以用扩增的产物来鉴定设计的引物是否正确。验证基因特异性引物的对照：单个引物的阴性对照：只用一个引物GSP来进行阴性对照。这样不应该产生任何的条带。如果可以看到明显的产物，应该改变循环的参数，或重新设计原始引物。利用两个GSPS进行阳性对照：（只有两个GSP可以产生重叠的时候才可以采用此步。）为了确定RNA样品中目的基因确实表达，利用两个GSP和接头连接的cDNA来产生阳性对照。可以产生两个引物之间的重叠大小的片段。如果没有这个片段，应该重复cDNA的合成，或者从一个不同的组织或细胞来源进行cDNA的合成。（了解）补充：

RACE产物的验证：

应该对RACE的片段进行验证,以此来确定是否已经扩增了理想的产物。如果得到的是多条带或者研究的是多基因家族的成员，验证是非常有用的。有3种验证RACE产物的方法：（1）比较由GSP和NGSP获得RACE产物。（2）Southernblot

（3）克隆并测序建议最好测得RACE产物的部分序列。有的时候需要嵌套引物的存在。（了解）补充：5.5.2cDNA差示分析法克隆基因前提：利用两套cDNA：tester和driver，其中tester中含有少数dirver中不具有的cDNA即差异基因，除此之外，二者完全相同。原理1：利用差减杂交，去除相同的部分原理2：利用增加接头的方法，特异指示tester，原理3：利用PCR的指数扩增，筛选差异基因cDNA差示分析法克隆基因-RDA代表性差异分析

representationaldifferenceanalysisRDAPage192了解差减杂交中的复性动力学testerdirver过量AA’aa’AA’a’aa’a该方法运用了杂交二级动力学原理，即丰度高的单链cDNA在退火时产生同源杂交速度快于丰度低的单链cDNA，从而使原来在丰度上有差别的单链cDNA相对含量达到基本一致，其中就包含T组特异的序列。AA’a’aa’a充分复性不充分复性不同的差异单链在丰度上趋于一致T组中与D组同源的全部复性成了杂化链，而T组有D组中无的链就“富集”起来了，而且不同的丰度上有差异的链，各自相对的丰度趋于一致RDA技术充分发挥了PCR以指数形式扩增双链模板，以线性形式扩增单链模板的特性，通过降低cDNA群体复杂度和多次更换cDNA两端接头引物等方法，达到克隆基因的目的。自身退火的testerDNA，即与driverDNA有差别的特异testerDNA片段的两端能和引物配对，有效地进行PCR指数扩增，其余的双链分子或单链分子不能以这种形式扩增，使目的片段得以富集。driverDNA与testerDNA通过多次的差减杂交和差式PCR分离的目的基因片段，经Northern杂交验证后用作探针就可从cDNA文库或基因组文库中筛选出全长的基因mRNAmRNAcDNAcDNA4碱基内切酶消化加12/24接头消化掉12碱基短链补平PCR消化，加新的接头消化，不加新接头1:100混合多轮差减杂交动力学富集T组特异的产物线性扩增指数扩增不扩增差异基因产物testerdriverRDA流程图Page192注意书上此图错误之处：开头的mRNA必须是testeranddriver；所谓填充材料应为探针材料即driver；ZAI1:100混合变性杂交后应加新的PCR，才能有三种结果；去掉“10”。新PCRcDNA差示分析法克隆基因-RDA

RDA法充分发挥了PCR以指数形式扩增双链DNA模板，而以线性形式扩增单链模板的特性，通过降低cDNA群体复杂性和更换cDNA两端接头等方法，特异扩增了目的基因片段。因为试验对象（Tester）和供试探针（Driver）在接受差示分析前均经一个4碱基切割酶处理，形成平均长度256bp的代表群（representation），保证绝大部分遗传信息能被扩增。每次T减D反应中两者物质的量比就要求达到1：100或更高，经过2-3次重复，T群体非特异性序列几乎没有偶然逃脱的可能性。5.4.3Gateway大规模克隆技术（了解）说明：gateway并不是上述克隆基因的技术，而只是一种大规模将目的基因从克隆载体转向表达载体的方法两步完成：

TOPO反应：PCR产物连入Entry载体

LR反应：PCR产物从Entry载体重组入表达载体A：TOPO反应：B：LR反应注意教科书上p194的错误：图（b）中右侧是连接反应的结果，不应该有表示重组的x线？5.4.4基因的图位克隆

（map-basedcloningorPositionalcloning）根据遗传连锁分析和染色体步移法，将基因定位到染色体的一个具体位置上，通过筛选基因组文库来克隆基因。图位克隆的核心是连锁分析技术连锁分析即通过基因与基因之间的重组系数来估计这两者之间的距离,若某种性状的基因与另外一个基因在子代不分离,即有连锁在一起的趋势。根据已知基因的染色体位置来判断未知的连锁基因的染色体位置。但是已知的基因与未知基因存在连锁关系的并不多,所以连锁分析对克隆大多数基因存在着一定的困难。RFLP等分子标记的出现使多态性基因标记存在于整个基因组内,解决了连锁分析中难以克服的困难。寻找连锁基因就转变成了寻找连锁标记。图位克隆1/8p193图位克隆的前提条件1、建立相应的文库，

例如BAC、YAC库。2、要有合适的与目的基因紧密连锁的分子标记做筛库的探针。图位克隆2/8基因图位克隆步骤（map-basedcloning）

(用于分离其编码产物未知的基因，理论上任何一个有突变的基因都可以通过这种方法克隆出来)

（1）根据突变通过家系分析等将基因定位在染色体上，并在目的基因两侧确定一对紧密连锁的分子标记（RFLP等）；

（2）利用这对分子标记作探针，通过染色体步移(chromosomewalking)技术或者染色体显微切割技术将位于这两个分子标记之间的含有目的基因的基因组片段克隆并分离出来；图位克隆3/8（3）确定含有目的基因的染色体片断，也就是再进一步做出更精细的染色体图谱；（4）最后在这些片段中进一步筛选目的基因，并作突变检测验证和功能分析（一般是通过遗传互补完成）

图位克隆4/8染色体步移法图示

Chromosomewalking1、首先找到一个与目标基因紧密连锁的分子标记，作为 起始克隆，在这个标记附近做物理图谱，然后以其中的标记序列为探针；2、从基因组文库中筛选具有重叠序的克隆1，进一步构建克隆1的物理图谱；3、根据克1的物理图谱设计新的探针如；此反复重复，可以逐步逼近，知道目的基因克隆，鉴定。p194图位克隆5/8染色体步移解释染色体步移的起点是具有一个与待分离的目的基因尽可能靠近的已经鉴定的分子标记。这种标记可以是RFLP，也可以是已知的基因克隆。先构建起点RFLP标记克隆的限制图，并把其中最靠近目的基因的限制片段亚克隆出来。此限制片段经放射性同位素标记之后，用作分子杂交探针，从基因组文库中筛选与起点克隆具有重叠序列的新克隆（称之为一步克隆）。重复进行上述的各个步骤。构建一步克隆的限制图，亚克隆其中最靠近目的基因的限制片段，该片段经放射性同位素标记之后，用作分子杂交探针从基因组文库中筛选与一步克隆具有重复序列的新克隆（称之为二步克隆）。如此重复进行多次，每得到一个新的克隆都更接近目的基因一步，直至最后获得了目的基因的克隆。由于这种技术是通过逐一克隆来自染色体基因组DNA的彼此重叠的序列，而慢慢靠近目的基因，因此形象地称之为染色体步移（chromosomewalking）。图位克隆6/8Map-basedcloningofTGD1(At1g19800).RecombinantspertotalchromosomesanalyzedintheF2populationareindicatedabovetherespectivemarkers.Complementingcosmidsaremarkedby(+)followingtheirdesignation.Theexon(thickbar)intronstructureoftheTGD1geneisshownatthebottom.Thenucleotidesubstitutionsinthethreemutantallelesareindicated.TheEMBOJournal(2003)22,2370–2379定位克隆7/85.4.5TAIL-PCRFusionprimerandnestedintegratedPCR(FPNI-PCR):anewhigh-efficiencystrategyforrapidchromosomewalkingorflankingsequencecloning在植物分子生物学研究中，经常需要克隆已知基因的旁侧序列，如分离基因的调控区，获得完整的基因序列，特别是在转基因作物研究中，分析外源基因插入位点的分子特征，对于转基因作物的安全评价及应用具有重要的现实意义基因序列旁侧序列