HBVDNA检测在乙肝治疗中的应用

HBVDNA检测在乙肝治疗中的应用第1页/共48页乙型肝炎：全球性的健康问题目前HBV携带者超过350million25–40%HBsAg阳性人群会死于肝硬化或肝癌全球350millionHBV携带者,75%在亚洲第2页/共48页

中表面抗原（S+preS2）核蛋白壳HBcAg(HBeAg)DNA聚合酶膜蛋白基因组DNA小表面抗原HBsAg(S)RNA引物大表面抗原（S+preS2+preS1)乙肝病毒颗粒示意图第3页/共48页慢性乙肝检测指标HBsAg–确定慢性乙肝HBeAg/anti-HBe–区分感染的不同时期HBV聚合酶–检测病毒的酶活性HBVDNA–检测病毒载量(病毒转录活性)HBcAg–检测病毒蛋白(病毒翻译活性)第4页/共48页HBV病毒基因第5页/共48页慢性乙型肝炎暴露后时间滴度ALTAnti-HBcSymptoms

5

601234

6

71

2

345

8

9

10HBsAgHBeAg月年HBVDNAAnti-HBe第6页/共48页慢性乙肝的三种临床表现HBeAg阳性慢性乙肝

HBeAg,ALT升高,HBV-DNA107to1011

拷贝每毫升，病理切片指征明显HBeAg阴性慢性乙肝

Anti-HBe,ALT升高，HBV-DNA104to108拷贝每毫升,病理切片指征明显HBsAg阴性携带期

Anti-HBe,ALT正常,HBV-DNA<101to104拷贝每毫升,病理切片变化极小EASL（欧洲肝病学会）将显著的复制水平定为HBV-DNA105

拷贝每毫升

第7页/共48页HBV保持复制活性（HBVDNA≥105copies/mL）,转氨酶3－6月内

持续升高，建议进行治疗对于e抗原阳性的慢性乙肝患者而言，采用干扰素治疗结束后，应该

检测e抗原、e抗体和HBVDNA水平，并且每6个月评估病毒学反应对于e抗原阴性的慢性乙肝患者而言，在经过抗病毒治疗后，检测血

清HBVDNA水平是评估病毒学反应的唯一方式欧洲肝病学会（EASL）2003乙肝防治指南/article/PIIS0168827803003787/fulltext#section7第8页/共48页HBV-DNA血清阳性病人，如果ALT>2ULN,要考虑治疗治疗期间，ALT、e抗原和HBV-DNA至少每3个月检测一次

亚太乙肝防治共识2003JournalofGastroenterologyandHepatology(2003)18,239–245第9页/共48页抗病毒一般适应症主要指标：HBVDNA≥105

拷贝/mL病毒学应答重要指标包括血清HBV，DNA检测不到(PCR法)

或低于检测下限，或较基线下降≥2log10

中华医学会肝病学分会/中华医学会感染病分会－慢性乙肝防治指南/GB/14740/21474/56295/index.html第10页/共48页为什么进行HBVDNA检测HBVDNA检测带给我们的益处目前HBVDNA的检测方法罗氏COBASAmplicor系统的优势新一代技术COBASTaqMan主要内容第11页/共48页HBVDNA检测带给我们的益处监测抗病毒治疗效果早期确定病毒学应答预测治疗后反应(HBsAg消失)预测耐药突变预测肝移植后复发检测HBsAg携带者的病毒的活动情况第12页/共48页指标正常/HBeAg阳性(n.31)anti-HBe阳性(n.15)转阴ALT

12

7HBeAg

12

NDdot-blothybridization.

12

7IgManti-HBc

ND

5AmplicorHBVMonitor

5

2HBsAg

3

2经治疗生化指标正常病人中病毒清除率第13页/共48页治疗中/后，应答者与不应答者HBVDNA水平的比较baseline1-3wks4-7wks8-11wks12-15wks16-24wks0-5mths6-11mths12-18mths1x1021x1041x1061x1081x1010HBVDNA

levelscopies/mlmean±SEMp=0.07p=0.2p<0.01p<0.001p<0.001p<0.001p<0.001p<0.001p<0.001-不应答者--应答者-治疗中治疗后第14页/共48页监测抗病毒治疗，预测耐药Puchhammer-StocklE.atal.JInfectDis181:2063,2000第15页/共48页HBVDNA载量显示携带者处于活动或非活动状态HBVDNAcopies/mlManesisK.etal.Gastroenterology122(7):2092-3,2002.1.E+021.E+031.E+041.E+051.E+061.E+071.E+081.E+09非活动状态活动状态第16页/共48页HBVDNA载量在肝移植中的应用

在肝移植中(LiverTransplantation)

为防治肝移植后的复发所采取的预防性治疗需要达到HBVDNA<104copies/mL的指标第17页/共48页为什么进行HBVDNA检测HBVDNA检测带给我们的益处目前HBVDNA的检测方法罗氏COBASAmplicor系统的优势新一代技术COBASTaqMan主要内容第18页/共48页目前HBVDNA的检测方法罗氏COBASAmplicorHBVMonitorDigeneHybridCapture杂交捕捉AbbottGenostix已消失BayerbDNA3.0国产HBVDNA检测试剂及方案罗氏COBASTaqManHBVmonitor第19页/共48页灵敏度比较TechnologyLODcopies/mLRocheAMPLICOR300DigeneHybridCapture~140,000AbbottGenostix~500,000BayerbDNA3.0~2,000RocheCobasTaqman~35国产试剂？第20页/共48页BranchedDNA(bDNA)第21页/共48页靶探针*Preamplifier*Microwell靶DNA捕获探针微孔板捕获探针Amplifier*withhybridizedLabelProbes**componentscontainingIso-C/Iso-G信号扩增BranchedDNA(bDNA)第22页/共48页国内Realtime方法HBV的检测现状第23页/共48页

PCR反应Mg2+dCTPdGTPdUTPdATPTaqDNAPolymeraseAmpErase®TargetDNAPCR第24页/共48页模板扩增1cycle=22cycle=43cycle=84cycle=165cycle=326cycle=647cycle=128SinglestrandRNA第25页/共48页水解探针

(TaqMan)模式淬灭基团报告荧光激发荧光淬灭激发荧光检测到信号第26页/共48页实时荧光定量模式0510152025300102030405060相对荧光强度None1ThresholdCycleThreshold(Ct)for108C/PCRHBVDNALogC/PCR2876543循环数第27页/共48页需要关注的国内实时荧光PCR检测的问题仪器90％源于进口，ABI、ROCHE、Bio-Rad…试剂100％国产，匹基、达安、科华、复星…第28页/共48页需要关注的国内实时荧光PCR检测的问题目前国内使用的进口RealtimePCR仪全部是针对科研用途研发的，缺乏临床诊断所需的质控系统所有进口PCR仪均为开放系统，除Roche外均不提供临检用试剂仪器厂家仅负责仪器运行是否正常，不对检测结果做任何保障第29页/共48页均采用外部标准曲线定量，标准品为重组质粒，与临床标本有无差异－－？质控品及标准品有无朔源性－－？试剂是否标明“域值”或“CrossBand”取值范围－？阳性质控是否给出标准值范围－－？标准品浓度是否覆盖声明的检测灵敏度－－？是否提供内部质控品－－？纯化产率如何控制－－？需要关注的国内实时荧光PCR检测的问题第30页/共48页检测结果标准化的问题标准化的各要素校准品试剂分析仪第31页/共48页为什么进行HBVDNA检测HBVDNA检测带给我们的益处目前HBVDNA的检测方法罗氏COBASAmplicor系统的优点新一代技术COBASTaqMan主要内容第32页/共48页COBASAmplicor检测原理杂交(37C)PCR扩增变性杂交清洗加AV-HRP加TMB第33页/共48页内部标准品(QS)全程监控样本制备/PCR过程

兼作定量参照BBBB

内部标准品DNA

模板DNA模板DNA内部标准品DNACOBASAmplicor：与固定在磁珠上的探针杂交内对照防止假阴结果，精确定量PCR第34页/共48页COBASAMPLICORHBVMonitor特点检测下线300copies/mL,>95%检出率线性范围300-200,000copies/mL同等定量亚型A-F血清或血浆100ul样本6小时检测时间,30分钟手工准备内部定量标准防污染系统第35页/共48页COBASAmplicorVSbDNA第36页/共48页COBASAmplicorvsbDNA第37页/共48页COBASAmplicorvsbDNACobasAmplicorbDNA标本准备乙醇沉淀磁珠吸附扩增靶序列光信号线性范围300－200,0002000-100,000,000特异性100%99.2%（96-98%)亚型A－FA－F污染控制有无定量方案内部标准品外部标准曲线Control数量3个12个报告时间8小时24小时第38页/共48页COBASAmplicorHBV灵敏度vs其它测试?-预测反跳？-预测突变？-预测肝移植复发风险？其他测试的灵敏度COBASAmplicorHBV灵敏度1101001,00010,000100,0001,000,00010,000,000100,000,000048122024WeeksoftherapyHBVDNAcopies/mL第39页/共48页为什么进行HBVDNA检测HBVDNA检测带给我们的益处目前HBVDNA的检测方法罗氏COBASAmplicor系统的优势新一代技术COBASTaqMan主要内容第40页/共48页COBASTaqMan实时荧光检测系统第41页/共48页COBASTaqMan特点及益处动态PCR整合定量标准，不需外标准曲线检测管封闭，无需开盖四色荧光通道(计划升级到六色) 检测管:k-tubeork-plate宽广的动力学范围连续检测检测时间从6小时减少到2～3小时 增加通量提供内质控减少污染风险允许多重PCR靶标检测可用于其他检测模式(杂交探针)处理过程简单可与AmpliPrep联用，实现自动化 益处特点第42页/共48页CO