FQPCR技术与儿科感染性疾病

FQPCR技术与儿科感染性疾病第1页/共30页主要内容1、聚合酶链式反应（PCR）的发展2、实时荧光定量PCR（FQ-PCR）的原理3、FQ-PCR与儿科感染性疾病（研究进展）4、达安公司儿科FQ-PCR相关产品第2页/共30页PCR的发明人——

加理·莫理斯（KaryB.Mullis）

达生命之源安健康之本/pcr.shtml第3页/共30页聚合酶链式反应PCR

（polymerasechainreaction）达生命之源安健康之本第4页/共30页PCR动力学原理——指数扩增第5页/共30页发射光实时荧光定量PCR(FluorescenceQuantitativePCR,FQ-PCR)实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR进程，最后通过软件标准曲线对起始模板进行定量分析的方法。第6页/共30页FQ-PCR原理简化图（simplifiedpictureofFQ-PCR）第7页/共30页FQ-PCR递增的荧光信号强度第8页/共30页检测范围广(101-1010

拷贝数/毫升)实时数据监测荧光曲线高灵敏度、高特异性、高稳定性高准确性定量分析FQ-PCR特点第9页/共30页荧光阈值&循环阈值（Ct值）第10页/共30页FQ-PCR扩增的理论模式理想PCR反应：

X=X0*2n非理想PCR反应：

X=X0(1+Ex)n

第11页/共30页在扩增产物达到阈值线时:XCt=X0(1+Ex)Ct=M(1)logM=logX0(1+Ex)Ct(2)logX0=-log(1+Ex)*

Ct+logM(3)数学原理推导过程第12页/共30页FQ-PCR定量原理图第13页/共30页FQ-PCR扩增曲线函数关系（1）起始模板量越多，达到荧光阈值的循环数就越少，即Ct值越小。（2）各模板起始拷贝数的对数（Log浓度）与Ct值呈线性反比关系，即起始模板量越多，Ct值越小。（3）通过已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线，根据未知样品Ct值，就可以计算出该样品中所含的起始模板量。第14页/共30页FQ-PCR在儿科感染性疾病中的应用肺炎支原体（mycoplasmapneumoniae,MP）呼吸道合胞病毒（respiratorysyncytialvirus,RSV）人巨细胞病毒（humancytomegalovirus,HCMV）EB病毒（epstein-barrvirus,EBv）肠道病毒（enterovirus71,EV71&coxsackievirus,CoxA16）第15页/共30页研究进展第16页/共30页肺炎支原体（mycoplasmapneumoniae,MP）CLINICALMICROBIOLOGYREVIEWS,Oct.2004,p.697–728第17页/共30页Science.2009Nov27;326(5957):1235-40.肺炎支原体（MP）蛋白质图谱绘制完成第18页/共30页Science：呼吸道合胞病毒三维图像（respiratorysyncytialvirus，RSV）Three-dimensional(3D)crystalstructureofadecameric,annularribonucleoproteincomplexoftheRSVnucleoprotein(N)boundtoRNA.Thevariableregionisinorange,withtheβ-hairpinhighlightedandlabeledwiththeRSV604resistancemutationsites.Science.2009Nov27;326(5957):1279-83.第19页/共30页人巨细胞病毒（humancytomegalovirus,HCMV）NewsandViews.NatureMedicine

6,863-864(2000).第20页/共30页Science：CMV的重复感染机制Science.2010Apr2;328(5974):102-6.EvasionofCD8+Tcellsiscriticalforsuperinfectionbycytomegalovirus.第21页/共30页EB病毒（epstein-barrvirus,EBv）EBv属于γ疱疹病毒亚科，是一种亲淋巴细胞病毒，能感染人及灵长类动物的B淋巴细胞。EBv颗粒呈圆形，直径150~180nm，基因组为双股DNA，长170~175kb。NatRevCancer.Epstein–Barrvirus:40yearson.(2004)4:757–768.第22页/共30页PNAS：EB病毒诱发肿瘤产生机制TheEpstein–Barrvirus(EBV)nuclearantigen(EBNA)-1istheonlyviralproteinexpressedinallEBV-carryingmalignancies,butitscontributiontooncogenesishasremainedenigmatic.WeshowthatEBNA-1induceschromosomalaberrations,DNAdouble-strandbreaks,andengagementoftheDNAdamageresponse(DDR).Thesesignsofgenomicinstabilityareassociatedwiththeproductionofreactiveoxygenspecies(ROS)andarereversedbyantioxidants.ThesefindingshighlightanovelfunctionofEBNA-1andapossiblemechanismbywhichexpressionofthisviralproteincouldcontributetomalignanttransformationandtumorprogression.ProcNatlAcadSciUSA.2009Feb17;106(7):2313-8.Epub2009Jan12.TheEpstein-Barrvirusnuclearantigen-1promotesgenomicinstabilityviainductionofreactiveoxygenspecies.第23页/共30页肠道病毒（enterovirus71,EV71&coxsackievirus,CoxA16）FQ-PCR特异性核酸（EV71、CoxA16）检测阳性被列为首选的检测方法和确诊依据。2009年7月，达安公司自主研发的三种肠道病毒检测试剂同时获得SFDA颁发的医疗器械注册证，是目前国内唯一获得权威部门认证的手足口病诊断产品。第24页/共30页小结对儿科感染性疾病病原体核酸的特异性诊断已越来越成为病人治疗所必需。采用FQ-PCR方法检测病原体DNA，可以早期、快速、准确、特异性诊断患者的感染病因。从而有助于避免滥用抗生素，了解患者病情、治疗疗效监测、阻断病毒传播等。第25页/共30页达安儿科系列产品肺炎支原体（MP）核酸定量检测试剂盒呼吸道合胞病毒（RSV）核酸定量检测试剂盒人巨细胞病毒（HCMV）核酸定量检测试剂盒EB病毒核酸扩增荧光检测试剂盒肠道病毒（EV71型）核酸定量检测试剂盒柯萨奇病毒A16型（CoxA16）核酸定量检测试剂盒第26页/共30页（1）荧光定量PCR法检测呼吸系统感染儿童肺炎支原体DNA的分析[J]临床儿科杂志

2002。（2）鼻咽癌患者血浆EB病毒DNA水平的动态变化与临床疗效的关系[J]癌症2002。（3）检测肺炎支原体抗体对小儿呼吸道疾病诊断的价值[J]

中国临床医药研究杂志2003。（4）荧光定量PCR与常规PCR检测沙眼衣原体、解脲支原体的比较[J]江西医学检验2004。（5）荧光定量PCR法检测呼吸道感染患儿支原体、衣原体感染[J]实用诊断与治疗杂志2005。（6）尿巨细胞病毒定量检测在巨细胞病毒感染诊断中的意义[J]实用儿科临床杂志2006。（7）先天性心脏病患儿体内人巨细胞病毒糖蛋白B基因型研究[J]中国预防医学杂志2008。（8）不同标本EV71和CoxA16检测对于手足口病重症患者的临床意义分析[J]中国卫生检验杂志2009。（9）肠道病毒核酸检测在儿童手足口病临床诊断中的价值及意义[J]中国医师进修杂志

2010。……使用FQ