结核病实验室诊断技术新进展课件

结核病实验室诊断技术新进展

山东省结核病防治中心王海英

2011.11.5

主要内容

结核病实验室常用的诊断技术和方法结核病实验室新的诊断技术和方法未来实验室结核病的诊断模式21、细菌学方法2、免疫学方法3、分子生物学方法33一、目前实验室常用检测方法2、免疫学方法抗体检测是结核病辅助诊断手段，对菌阴肺结核有一定的参考价值。

1、酶联免疫吸附试验2、免疫胶体金标技术

55一、目前实验室常用检测方法67潜伏结核感染者的筛查结核菌素PPD试验99

二、

新诊断技术和方法

分类

新方法用途细菌学检查LED(发光二极管显微镜)涂片检查

免疫学方法-干扰素释放实验潜伏感染者分子生物学LAMP(等温扩增)涂阴\涂阳LPA(线性探针)

MDR-TB,鉴定Genechip(基因芯片)MDR-TB,鉴定GeneXpert(多色巢式定量PCR)耐RFP,涂阴分子分型技术指纹图谱分析

其他DNA测序法突变检测

HPLC胞壁成分检测

1010

二、

新诊断技术和方法

1、细菌学检查

发光二极管（LED）荧光显微镜光源寿命长（30,000h）不需要预热不需要暗室可用现有的显微镜可使用电池电源与通常荧光显微镜的判定一致率98.0%两种方法观察结果Z-N染色镜检结果LED镜检结果

二、

新诊断技术和方法

中盖项目LED评估结果读片时间LED读片时间120.03±38.88秒，明场显微镜206.31±75.86秒（p=0.00）使用接受度调查对于进一步推广建议，大多数(8/9)认为应进一步推广，但其中有2人认为应在日工作量大的实验室优先使用1414二、

新诊断技术和方法

单核细胞分离TB抗原刺激，IFN-

释放与标记的二抗结合

酶作用标记物－显色每一斑点代表释放IFN-的一个细胞YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYIFN-抗原一抗捕获IFN-

2、免疫学方法：-干扰素释放实验BCG进化过程1717二、

新诊断技术和方法（1）环介导等温扩增技术(Loopmediatedisothermalamplification，LAMP)：Eiken,Japan•可同时检测患者是否感染结核所用仪器设备极其简单63℃扩增（避免非特异性扩增多对引物（提高特异性和速度）：靶基因6个不同区域，设计4种引物•对涂阴培阳病人具有非常高的敏感性和特异性•密闭系统(没有污染的风险）•快速，两小时内即可得到检测结果，•肉眼观察

1818二、

新诊断技术和方法（1）环介导等温扩增技术(Loopmediatedisothermalamplification，LAMP)临床标本（咯痰等）DNA提取基因扩增基因检出标本处理Extractionsolution1and210min,100℃1min,2000gSupernatant，captureDNAReconstitutereactionmix40min,67℃LAMPamplification＋－PCR

LAMP・需要使用PCR扩增仪・设计特异性的两条引物・扩增效率:107・不需要使用PCR扩增仪・多对引物保证扩增的特异性・扩增效率:1010二、

新诊断技术和方法（1）环介导等温扩增技术(Loopmediatedisothermalamplification，LAMP)192121二、

新诊断技术和方法3、分子生物学（2）

线性探针检测技术（LPA）耐药分子诊断的基本原理利福平/异烟肼耐药性的产生与结核分枝杆菌特定基因某些位点的突变相关。抗结核药基因基因功能耐药百分比利福平rpoB编码DNA依赖RNA聚合酶，参与mRNA转录过程>90%异烟肼katG编码过氧化氢-过氧化物酶，参与INH体内的转化40-100%高水平耐药inhA编码烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)依赖的enoyl-ACP还原酶，参与脂酸的合成appr25%低水平耐药2222

DNA提取标本①固体或液体培养基培养的菌种②抗酸染色涂片阳性标本方法①超声波裂解②GenoLyse试剂盒0.5～1

h2323

PCR扩增①不同标本,扩增参数不同培养菌种：扩增20个循环涂阳标本：扩增30个循环②引物：生物素标记③多重PCR扩增2.5～3h2525

结果判读0.5h

中盖项目线性探针检测利福平评价

利福平线性探针传统药敏合计一致率灵敏度特异性PPVNPV耐药敏感合计耐药1354117693.6%75.0%96.5%76.7%96.2%敏感451127172合HOPOLICYSTATEMENT27JUNE2008通过系统评估和META分析（和DST比较）：结核分枝杆菌或涂阳的痰标本RIP：敏感性≥97%，特异性≥99%WHOPOLICYSTATEMENT

27JUNE2008countylevel.线性探针分析不能替代目前传统的培养和药敏试验，涂阴标本和XDR-TB的证实都需要进行传统的培养。29基因芯片基因芯片指采用光导原位合成或微量点样等方法，将核酸片段有序地固化于支持物的表面，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。二、

新诊断技术和方法（3）Genechip(基因芯片)30检测过程杂交反应杂交清洗清洗干燥扫描检测数据分析检测分析PCR扩增DNA提取样品制备二、

新诊断技术和方法（3）Genechip(基因芯片)31芯片结果图例芯片杂交质控芯片制备质控芯片制备质控芯片杂交质控靶基因扩增质控阴性对照质控空白对照质控二、

新诊断技术和方法（3）Genechip(基因芯片)323333二、

新诊断技术和方法（3）Genechip(基因芯片)结核耐药检测基因芯片结核耐药检测芯片获北京市自主创新产品证书获国家医疗器械证书和欧盟CE认证样品制备仪杂交仪通

量：两个一线抗结核药速

度：

6小时（比传统药敏试验法快50-100倍）灵敏度：103CFU/反应特异性：对照设计严谨；自动判读基于rpoB/katG/inhA的基因突变，快速检测分离株或者痰样本中结核杆菌多药耐药（利福平、异烟肼）。软件判读激光共焦扫描仪InternationalJournalofTuberculosisandLungDisease,13:914-920,2009（IF=2.3）是一种半定量巢式实时PCR的检测方法，能检测杆菌和利福平耐药性。扩增出ropB基因含有81bp的核心区序列，探针能够区分野生型基因序列与突变型基因序列。集样本准备、扩增和实时检测于一体。盒子中含有冻干的试剂，缓冲液和洗涤液。使用6色激光检测装置对靶核酸进行实时检测。二、

新诊断技术和方法（4）GeneXpert(多色巢式定量PCR)检测技术34•标本类型：临床痰标本，或浓缩处理后的标本（涂阳或涂阴培阳），不能用于用于治疗随访的病人。•对涂阴培阳病人具有非常高的敏感性和特异性•可同时检测患者是否结核以及是否对利福平耐药•两小时内即可得到检测结果，所用仪器设备简单•不需要生物安全柜，满足涂片试验条件的实验室•二、

新诊断技术和方法（4）GeneXpert(多色巢式定量PCR)检测技术35•利福平耐药阴性预测值：

在结核病利福平耐药流行低或高的地区，NPV大于99%.即阴性结果能排除RIP耐药•利福平耐药阳性预测值：RIP耐药流行＞15%，PPV＞90%RIP耐药流行5%～10%，PPV：71%～84%RIP耐药流行＜5%，PPV：＜70%，在这种情况下，RIP耐药的结果需要传统的DST证实。二、

新诊断技术和方法（4）GeneXpert(多色巢式定量PCR)检测技术36基于核酸扩增的一步法利福平耐药检测XpertTMMTB/Rif技术平台利福平的耐药性分析

喹诺酮类药物耐药性

HIV病毒载量分析自动化得标本处理和检测，可以在2小时内出结果二、

新诊断技术和方法（4）GeneXpert(多色巢式定量PCR)检测技术3838结核分枝杆菌菌株水平鉴定最早采用生化分析、血清学技术和噬菌体分型等技术进行分析，但由于这些方法的局限性而未得到广泛应用。基于核酸基础上的分子流行病学研究技术是对结核病等感染性疾病进行检测的一个强有力的手段，可以进行结核菌传播的研究，结核病实验室交叉污染的研究，判断结核再感染或复发以及国际间传播的研究。二、

新诊断技术和方法（5）分子分型技术3939

简单介绍以下三种分型技术：（1）插入序列6110限制性片段长度多态性分析：IS6110（2）直接重复片段及寡核苷酸多态性分型：间隔寡核苷酸分

型(spaceroligonucleotidetyping,Spoligotyping)（3）分枝杆菌分散重复单元-可变数目串联重复序列：(mycobacterialinterspersedrepetitiveunits-variablenumbertandemrepeats,MIRU-VNTR)二、

新诊断技术和方法3、分子生物学（5）分子分型技术4040插入序列6110限制性片段长度多态性分析：

IS6110是一个只存在于结核分枝杆菌复合群基因组中的插入序列，长度为1355bp，具有高度的保守性，属于IS3家族。不同结核菌株IS6110的数目和位置不同。在IS6110序列中，限制性内切酶PvuII的酶切位点只有一个，经酶切后产生大小两个不同的片段，再与只针对酶切位点右侧的245bp探针杂交，则杂交后产生的条带数即为菌株IS6110拷贝数。二、

新诊断技术和方法（5）分子分型技术4141插入序列6110限制性片段长度多态性分析：IS6110这种方法存在一定的缺陷：①对于基因组中IS6110低拷贝<6或缺陷的分辨能力有限；②需要大量的基因组DNA，操作步骤繁琐且工作量大；③各实验室所采用的IS6110-RFLP分型方法的标准不统一，不同实验室的IS6110-RFLP分型结果难于进行比对。二、

新诊断技术和方法（5）分子分型技术4242直接重复片段及寡核苷酸多态性分型：

基于直接重复区（RD区）的多态性。DR区只出现于结核分枝杆菌复合群中。由若干个保守的长为36bp的直接重复序列组成，并被非重复序列即间隔区分开。每隔间隔区序列长为34-41bp。通常间隔区的顺序在所有菌株都是相同的，但可能发生某一间隔区的插入或缺失，因此利用Spoligotyping就可以对结核分支杆菌进行株水平的鉴定。

可以区分结核分枝杆菌复合群和M.bovis以及M.bovisBCG二、

新诊断技术和方法（5）分子分型技术4343直接重复片段及寡核苷酸多态性分型：Spoligotyping①该方法对菌株的分辨能力明显弱于IS6110一RFLP方法，特别是不能有效分辨北京家族菌株，而在我国目前流行的结核菌株中，大约50%属于北京家族；②同时与其他方法相比有高估菌株间流行病学联系的倾向。二、

新诊断技术和方法3、分子生物学4444可变数目串联重复序列：MIRU-VNTR该技术是近年发展起来的以PCR为基础的分型技术。MIRU为40-100bp的DNA元件，通常以串联重复形式散步于结核分枝杆菌复合群基因中。H37Rv基因组中含41个MIRU区，其中有12个区具有多态性，其拷贝数在不同菌株之间12个区拷贝数在不同菌株之间存在差异。MIRU技术利用不同菌株之间这12个区拷贝数的差异达到鉴定菌株的目的。二、

新诊断技术和方法3、分子生物学4545可变数目串联重复序列：MIRU-VNTR该方法操作简单,分辨率高,结果容易分析,具有很高的可重复性,在实验室内和实验室间具有非常好的可比性,并能提供数字化的分型信息,适宜于进行大量样本和网络化分析。二、

新诊断技术和方法3、分子生物学（5）分子分型技术4646DNA测序法被认为是检测变异的“金标准”，可检测出待检基因上的所有突变位置和