11-金黄色葡萄球菌PFGE方案

/金黄色葡萄球菌脉冲场凝胶电泳标准操作程序编号PN－SOP－１1执行日期2010年12月１5日第一天1。菌悬液的制备1)在Fａlcoｎ20５４管上标记样品名称和空白对照，分别加入约1—２mlCＳB缓冲液。2）在1。５mｌｅppeｎｄorf管上标记好对应样品的名称。３）用棉棒从培养皿上刮取适量细菌，悬浊于ＣSB中,用ｅppenｄｏrｆ分光光度计测其ＯＤ值，调整至5.5～6.5之间。注：如果样品数量多,调完ＯD后先存放于４℃4）取2５0µl菌悬液于相应的1．５mleｐpendｏrf管中.５)加入2µl溶葡萄球菌酶（1mg／ml）,用移液枪充分吹打。不需振荡摇匀。2。胶块的制备1）准备1０ml的1％SＫG(称取0．1ｇSKG溶于ＴE,用微波炉加热至完全溶解，放在53℃～562)取250µl预热（53℃~５６℃)的SKG，与2５03)将混合物立即加入模具，避免产生气泡，在室温下凝固10~1５分钟或置于4℃3。细胞的裂解1)在50ml的scｒｅw－caｐtｕbｅ上做好标记.２）配制细胞裂解液（CLＢ)，参见表1。蛋白酶K原液须放在冰上或冰盒里。表1样本数量CLB蛋白酶K(20mg/ml）14mｌ３0µl１040mｌ3０0µｌ3)每个管子加入4ml蛋白酶Ｋ/CＬB混合液。保证胶块在液面下而不在管壁上。4）将管子放在５4℃5）将纯水和TE放在５4℃4。洗胶块1）从水浴摇床中拿出scｒew-cap管,盖上绿色的ｓｃreened—cａｐ，轻轻倒掉CＬB.2)每管中加入1５ｍl预热的纯水。确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上，放回５4℃3）倒掉水,加入15ｍｌ预热的TＥ，在54℃4)倒掉TE，加入5mlTE，放在4℃第二天5.胶块内DNA的酶切1）准备30℃和3７2）按照表２,配制SmaＩ的稀释缓冲液,混匀。注意:须带手套操作，缓冲液和BSA置于冰上。表2试剂（Takａra)µl/胶块µl/7胶块µl／12胶块纯水１６0µl1120µl１920µl1０×TBuｆｆｅr2０µl140µｌ２40µlBＳA（0。1%）20140240总体积200µｌ１４00µl2４00µl3）按照表3，配置XbaＩ的稀释缓冲液。注意：须带手套操作，缓冲液和BSA置于冰上。表3试剂（Pｒomega）µl/胶块µl/3胶块纯水１78µｌ53４µlBｕfferD２０µｌ60µｌBSA（１0mg/mｌ）２6总体积200µl600µl4)在每个1.5mｌeppenｄorf管中加入200µｌ稀释缓冲液。5)用刀片切下2mm宽的胶块放入1.5mlepｐeｎdorf管中.确保胶块在液面下面。将剩余的胶块放回原来的TE中.６）用同样的方法处理标准株H9812的胶块,放入XbａI缓冲液中.7）将XbaI管子放在37℃水浴中，ＳmaI管子放在30８）在用稀释缓冲液孵育的过程中，按照以下的比例配制酶切缓冲液，混匀。表4试剂（Takaｒa）µｌ/胶块µｌ/７胶块µl/12胶块纯水155µl1085µl1860µl10×TBuｆfeｒ20µｌ１40µl2４0µlBＳＡ(０.１％）20140240SmaＩ5３560总体积200µl１4０0µｌ240０µl表５试剂（Proｍega)µl/胶块µl/３胶块纯水1７３µｌ519µｌBｕｆｆeｒD２0µl60µlBSＡ（10ｍg/mｌ）２6XbaI515总体积200µｌ6０0µl９)孵育完，用移液枪吸出液体,吸液时枪头应贴到管底，注意避免破坏胶块。10)每管加入2００µl内切酶混合液，确保胶块在液面的下面。11）将XbaI管子放在37℃，SｍaI管子放在306。制备1%胶1）称取１ｇSKG,溶于100ml０.5×TBE缓冲液中.1５孔模具需配制１５0ｍl体积的胶。２）微波炉加热约２分钟,每20妙混匀,直至完全溶解。3）放在５3℃～567.加样1）调整梳子的高度，使梳子齿与胶槽的底面相接触。用水平仪调整胶槽使其水平。2）从3７℃3）每管加入20０µl０．5×TBＥ,用枪头冲洗胶块。4)把梳子平放在胶槽上,把胶块加在梳子齿上。如果用的是10个齿的梳子，把标准菌株H9812加在第1、５、1０个齿上，若为１5个齿的梳子则放在第1、５、１0、15个齿上。5）把梳子放入胶槽，确保所有的胶块在一条线上，并且胶块与胶槽的底面相接触。从胶槽的下部中央缓慢到入100ｍｌ熔化的在53℃~568.电泳:设置电泳参数。大、小胶均用此参数.Iｎiｔialsｗitｃｈｔimｅ＝4。0seｃonｄsFｉnａlｓwitchtiｍe＝4０。0sｅconds14cm宽×13ｃm长的胶电泳时间为１９小时启动“SｔaｒtＲun"第三天9.图像的获取1）取出胶，放在盛放40０mｌEB溶液的托盘内（EＢ储存液浓度为10mg／ml，1:10，０00稀释，即在400ｍl水中加入40µl储存液）,摇３０分钟。注意:EB是致畸剂。储存在棕色瓶中的ＥB稀释液可以用5次。废弃的ＥB溶液应妥善处理。２)用纯水冲洗胶即可读取图象。３）电泳图像通常用BIO－ＲAD的GEＬDOC2000或其它成像系统来获取。图像需为IBM兼容的未压缩的ＴIＦＦ格式,且分辨力≥768x640像素。1０．PFGE图谱分析例图１,8,１5为marker;２-１,8,１5为marker;