第七章蛋白质或多肽的放射性标记及分析方法

第七章蛋白质或多肽的放射性标记及分析方法演示文稿当前1页，总共48页。优选第七章蛋白质或多肽的放射性标记及分析方法当前2页，总共48页。三、32P标记分子杂交实验证明遗传信息从DNA到mRNA的转录

Spiegelman利用人工合成RNA-DNA杂种分子的实验证明RNA分子的核苷酸顺序由DNA转录决定，RNA分子的生物信息来自DNA。把双链DNA加热，使产生单链DNA分子，若在热溶液逐渐冷却过程中加入与该DNA链互补的单链mRNA，则在形成复性DNA分子的同时会有DNA-RNA杂种分子形成。形成杂种分子的条件是这种RNA分子的核苷酸顺序与DNA分子中某些核苷酸顺序互补。利用这个原理，可以鉴别RNA与DNA碱基顺序是否有互补的特性。实验也可采用放射性标记技术进行。将T4噬菌体感染的大肠杆菌(E．Coli)放在含32PO43－的培养基中培养，提取32P标记的RNA，将32P-RNA分别加到E．Coli的DNA热溶液和T4噬菌体的DNA热溶液中，溶液慢慢冷却后上膜过滤，除去游离RNA，测量膜上物质的32P放射性活度。结果发现加到T4DNA溶液中的32P-RNA大部分已和T4DNA形成杂交分子并留在膜上，而加到E．ColiDNA溶液中的32P-RNA很少与E．ColiDNA形成杂交分子因此很少留在膜上。这个实验证明了感染后合成的RNA和噬菌体DNA的碱基顺序互补，前者的碱基顺序由后者决定，同时感染后合成的RNA并下与宿主细胞DNA互补。这个结果和关于噬菌体DNA是合成噬菌体mRNA的模板这一早期推测完全一致。

当前3页，总共48页。四、3H-亮氨酸标记网织红血球培养实验证明多肽链合成起始于氨基末端

多肽链是从氨基末端还是从羧基末端开始延伸的，Dintzis的放射性标记实验作出了回答。把网织红血球加3H标记的亮氨酸3H-Leu作体外培养，蛋白质合成后分离提取出新合成的血红蛋白，分析该蛋白肽链中的放射性分布。实际上，如果培养的时间相对较长时(如3min)，那么在合成的肽链中，有一些是在加入3H-Leu前已接近完全合成的，这些肽链中只在远离生长点的地方有3H-Leu；另一些肽链是在加入3H-Leu后才开始合成的，这些肽链几乎整条链上都分布有3H-Leu还有更多的肽链一段在3H-Leu加入前另一段在3H-Leu加入后合成，且长短不一。这样，血红蛋白链有如图7-2所示的3H-Leu分布。如果培养的时间很短(如30s)，则只有在3H-Leu加入前已经合成了某一片段的那些链，才有可能完成整个链的合成。故靠近某一端的3H-Leu放射性比另一端强许多(图7-2Hp448)且有一定的梯度分布。实验表明，血红蛋白肽链中靠近氨基末端的放射性比活度最低，靠近羧基末端的则最高，从而证明肽链的合成是由氨基端到羧基端的方向延伸的。

当前4页，总共48页。当前5页，总共48页。五、14C标记氨酰基—tRNA对三联体遗传密码的研究

蛋白质是一类按一定顺序排列起来的氨基酸所组成的多肽结构，它的生物合成过程是mRNA密码信息经核糖体解译的转译过程。放射性标记实验技术在了解这个遗传密码的解读上也有重要作用。实验原理如下：由A，U，G，C四种核糖核苷酸中的三种人工合成某一种三核苷酸，取20种氨酰基-tRNA中的一种用14C或3H标记，使该三核苷酸与19种非标记及1种标记的氨酰基-tRNA以及适当的核糖体组成一个反应系统。三核苷酸代表mRNA上的一个三联体密码，使相应的氨酰基—tRNA结合到核糖体上。反应结束后看哪一种标记的氨酰基-tRNA可被结合，定出该三核苷酸密码与哪一种标记的氨酰基-tRNA有对应的结合关系，从而可以确定mRNA上三联体密码子在转译成蛋白质中的意义。当前6页，总共48页。本部分主要内容：第七章蛋白质(或多肽)的放射性标记及分析方法；第八章同位素示踪技术在DNA序列测定中的应用；第九章放射性核酸探针的制备及其应用。当前7页，总共48页。第七章蛋白质(或多肽)的放射性标记及分析方法一、蛋白质（或多肽）的放射性标记方法在现代生物和医学的研究和应用中，需要将胰岛素等具有生物活性的蛋白质（或多肽）进行特异性的标记，以研究它们在生物体内或离体状态下的生理生化特性及功能与作用机制等。目前主要的标记类型有：放射性标记酶标记荧光标记化学发光标记。蛋白质（或多肽）的放射性标记，目前主要有：化学标记法生物合成标记法当前8页，总共48页。1、化学标记法（1）125I标记

125I的半衰期为60天，衰变方式为电子俘获（EC），能量为35kev。为了叙述方便将方法具体化，我们主要以胰岛素的125I标记为例。胰岛素分子是有A，B两条多肽链组成的，分子中共用4个酪氨酸残基，即A14、A19、B16和B26酪氨酸。在没有-SH存在的氧化条件下，125I可置换酪氨酸残基苯环上羟基邻位的氢原子，使之碘化为单碘或双碘酪氨酸。因胰岛素分子中4个Tyr都可以发生此反应，使A14、A19、B16和B26中被碘化的Tyr不只一个。但研究表明，单碘胰岛素比双碘胰岛素具有更高的免疫活性。生物学家、放免学家、医学家和实验内分泌学家在制备单碘胰岛素上作了各种方法学的探索。由于碘化方法不同，对胰岛素的碘化情况也不尽相同。当前9页，总共48页。

A14A19B16B26当前10页，总共48页。当前11页，总共48页。①氯胺T碘化法（CT法）A、原理放射性碘可参与到蛋白质酪氨酸残基上，形成单碘或双碘Tyr。Na125I的碘是负离子（I-），只有正碘离子（I）才能取代Tyr苯环上与羟基邻位（3位或5位）的质子。因此，反应需加氧化剂。氯胺T（学名：氯胺赶对甲苯磺酸钠）就是一种催化剂，它可从负碘离子上移去一对电子，使之转变成正离子（I-→I＋）或125I碘化反应几乎在瞬间完成。标记的蛋白质用凝胶过滤等方法提纯。反应式如下：当前12页，总共48页。B、操作方法取胰岛素液10µl（5µl），0.4mol/L，pH7.4磷酸缓冲液50µl，Na125I液7.4×107Bq氯胺T液10µl(100µg)。混匀反应1-3min。加入偏亚硫酸钠(Na2S2O4)液100µl（250µg）（还原过剩的氯胺T），终止反应。反应混合物一般用SphadexG25或其他柱层析法脱盐得到的标记物是4种单碘胰岛素和双碘胰岛素的混合物。分离方法各种碘标胰岛素（将在下面介绍）。Freychet和Linde等人以大鼠脂细胞来测定氯胺T法标记的胰岛素的生物活性，发现仅为天然胰岛素的60-70%。当前13页，总共48页。C、优缺点

优点：简单、快速。缺点：由于终止反应时，所用的还原剂—偏亚硫酸纳的浓度太高，对蛋白质中的二硫键会产生还原作用；标记时，虽然蛋白质分子暴露于氯胺T下的时间很短，但蛋白质分子还是可被氧化脱羧和脱氨。因此，这种碘化反应难以控制，会出现较多的双Tyr取代蛋白质或双碘蛋白质，以及较多的损伤蛋白质，而使产物的免疫活性及生物活性都达不到受体分析的要求。同时，还原剂可能残留于标记物中，使其保存（有效）期较短，一般只有1～1.5个月。

当前14页，总共48页。②酶促碘化法

70年代人们开始用酶标记法，此法可避免氧化剂与蛋白质分子直接接触。基本原理：将氧化型的125I-结合于酶分子上，形成“酶—125I”复合物，然后在酶的催化作用下，将125I转移到蛋白质的Tyr残基上。酶标法得到的产物，标记损伤可大大减少，反应条件也较易控制。主要有三种：

当前15页，总共48页。A、辣根过氧化物酶碘化法（Horseperoxidase，HPO法）

辣根过氧化物酶能与125I形成酶碘化合物，H2O2由葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖产生，当I/胰岛素的比值为1.0时，标记产物中单碘胰岛素约占99%。其中A19占98%，A14、B16和B26单碘化合物均小于1%。比活度可达4.4×106Bp/ug左右。几乎只产生一种单碘化合物，即A19单碘胰岛素，是HPO法的优点。已知A19-Tyr在胰岛素单体上位于表面一个不变的区域。这个区域被认为是胰岛素受体结合的区域。这可以解释HPO法所得到标记化合物以A19单[125I]-胰岛素为主的现象。但随着I/胰岛素比值的增加，A14、B16和B26单碘标记率也随之增加；此外，B16和B26残基位于同一表面区域，在HPO法中，B16和B26单碘化合物却很低。此说明，HPO将125I转移到Tyr残基上的过程，除了接触Tyr的难易程度和空间位置外，还包括酶促作用的选择性。详细机理至今不甚明了（涉及到蛋白质构象问题）。

当前16页，总共48页。B、乳过氧化物酶碘化法（Lactoperoxidase，LPO法）

1971年Ferychet等人首先采用此法，并用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离标记混合物，得到了A14和A19两种单碘胰岛素。标记方法如下：取Na125I37×107/10～30µl、磷酸缓冲液（PBS）（0.25～0.5mol/L，）10µl、胰岛素10µg/10µl、H2O250µg/10µl、LPO1µg/5µl混合，反应5min，加40%蔗糖40～50µl混合，上凝胶柱电泳。在中性条件下，乳过氧化物酶可与125I形成“酶-125I”复合物，然后将125I转移到Tyr残基上。此法与HPO法相似，但不同的是，LPO法所得到的单碘胰岛素中，A14含量较高，可占所得单碘胰岛素的35～70%；A19标记物比HPO法少。A链单碘胰岛素占全部标记物的98～99%，B链单碘标记物仅占1～2%。LPO法较简便，省时，得到的A14单碘标记物较多，宜作受体分析。

当前17页，总共48页。C、LPO-葡萄糖氧化酶碘化法（Lactoperoxidase-GlucoseOxidase：LPO-GO）由于在LPO碘化法中，H2O2是直接加入的，因此对蛋白质（或多肽）的损伤较大。1977年，Tower等人用葡萄糖氧化酶在溶液中催化氧和β-D-葡萄糖，使之连续不断的产生少量的H2O2。这比直接加入H2O2易于控制，避免H2O2太多和局部浓度太大对蛋白质或多肽分子中二硫键和色氨酸，胱氨酸等的损伤太大，从而减少标记损伤，使125I化的蛋白质或多肽能保持良好的生物或免疫活性。

当前18页，总共48页。③联结碘化法

这是近年来常用的蛋白质碘化法。它是通过末端氨基与碘化试剂形成肽键而完成蛋白质的标记。碘化试剂有：碘苯胺、甲基-对-羟基苯亚胺脂、碘化对氨基苯磺酸、二磺荧光素和Bolton-Hunter试剂（学名：3-（4-羟基苯）-丙酸琥珀酰亚胺脂）。其中以Bolton-Hunter试剂用的最为广泛，它是N-羟基丁二酰和碘化对羟基丙酸形成的脂，可在实验室从N-琥珀酰3-（4-羟基苯）-丙酸盐合成。须注意：Bolton-Hunter试剂在水中很容易失活，酶促法显著减弱其活性，而Bolton-Hunter试剂对活性毫无影响。

当前19页，总共48页。④固相碘化法

IODOGEN是近年来发展起来的一种固相125I化标记试剂。名称1,3,4,6-四氯-32,62-二苯基甘（代）联脲（1,3,4,6-Tetrachloro-32,62-diphenlglycouril）。1978年Fraker和Speck首次介绍用IODOGEN对蛋白质和细胞膜进行125I标记。IODOGEN不溶于水，故可以固相形式参与蛋白质的碘化过程。以后相继报导用IODOGEN碘化标记大肠杆菌核糖体蛋白质、家兔网织细胞核糖体蛋白质、仙台病毒、人生长激素和促甲状腺素、人细胞和组织培养的细胞、大鼠纤维蛋白质和人纤维蛋白质等。下面介绍利用IODOGEN125I标记方法标记经去污剂SarkosylNL-97裂解的甲型流感病毒的基本过程。A、IODOGEN固相的制备

IODOGEN1mg溶于1ml氯仿中，取10µl加入12×75mm玻璃试管中，室温下在通风橱内用氮气气流将溶剂挥发，待彻底干燥后即可用于标记。B、流感病毒的裂解纯化的甲型流感病毒X-31（H3N2）50µg，悬浮于100mlSTE（PH8.0）中，加入25µl10%SarkosylNL-97，37℃温育15min。

当前20页，总共48页。C、碘化反应用STE（0.15M氯化钠、10mMTris、1mMEDTA、PH8.0）充分洗涤。已制备好的IODOGEN固相反应器，以除去管壁上附着不牢固的IODOGEN。将已裂解的病毒悬浮液加入管内，随即加入125I-NaI0.5mCi（110mCi/ml），室温下反应30min，间或轻轻震荡试管，以增加病毒和125I-NaI与固相IODOGEN的接触机会。吸出管内全部液体，则反应自行终止。以葡聚糖凝胶G-50柱层析除去未标记游离碘。标记病毒的放射性可达3～10mCi/mg蛋白。D、对IODOGEN碘化法的评价此法非常简便有效。碘化反应可在0～37℃下进行，反应不受去污剂、变性条件或酶抑制剂的影响。样品从反应管取出后反应即终止。样品可直接进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。因此非常适合于蛋白质体标记。IODOGEN固相管一次可制多个，并能在室温下长期保存。在SDS或SarkosylNL-97等变性剂存在下，IODOGEN能有效的标记各种蛋白质或多肽，所获得的放射性活度一般高于氯胺T法。

当前21页，总共48页。（2）3H和14C标记①甲基化反应和烷基化反应

蛋白质的赖氨酸（或末端）氨基可与甲醛和硼氢化物发生还原甲基化反应：Pro-NH2+2HCHO+1/2NaBH4→Pro-N(CH3)2+1/2NaH2BO3+1/2H2O因此，用3H或14C-甲醛或3H-硼氢物可标记蛋白质。按每个氨基加上两个甲基计算，用14C-甲醛可得比放射性为5×106dpm/mg的标记蛋白质，相当于最大理论值的20%。用3H-硼氢物标记蛋白质，其比放射性可达3.5×108dpm/mg蛋白质，比氯胺T碘化法高。NaHB4在水溶液中易分解，这种分解在碱性PH值较慢，在室温pH9时，其T1/2也只有10min；在pH8则仅1min左右。氰基硼氢化钠在水溶液中稳定，用它代替NaHB4，反应可在pH7条件下进行，这有利于某些不稳定蛋白质的标记。此外，在蛋白质的多种残基，如半胱氨酸、组氨酸、蛋氨酸和赖氨酸的侧链上，很容易引入羟甲基。d-卤酸盐，如碘乙酸钠或溴乙酸钠是常用的烷化试剂。利用3H或14C烷化试剂可标记蛋白质。

当前22页，总共48页。②3H和1H的交换反应溶剂中的3H可与肽键和一级胺上的1H交换。利用这个反应可将3H标记在蛋白质上。交换法简便，反应条件温和，不损伤蛋白质活性。但因交换法反应是可逆的，标记原子可迅速回到溶液中9比如2小时内可减少到25%）。因此，用这种方法标记的样品应及时进行分析和测定。

当前23页，总共48页。（3）金属蛋白（Metalloproteins）中金属原子的标记生物体内有一些含金属原子的蛋白质（酶），它们在生物体内起着非常重要的作用。如固氮酶的两个组分中，Fe蛋白是一种Fe-S蛋白，MoFe蛋白是由两种不同的亚单位组成的四聚体，并含两个络合和还原底物的FeMoCo与两个可能起传递和贮存电子作用的、由双Fe4S4组成的P-cluster。因此MoFe蛋白是含金属Mo、Fe的酶。自然界中还存在分别以V和Fe取代Mo（第一固氮酶体系）的第二、第三固氮酶体系。这些事实表明可固氮酶在所含金属种类方面具有生物多样性。目前，许多金属原子和生物大分子的结构和功能的关系还不很清楚。同位素示踪技术是进行此项研究的重要手段之一。下面我们主要以99Mo标记MoFe蛋白为例，进行这方面的探讨。其化学标记主要有拆卸与组装法。先将蛋白质中的金属部分在某种条件下拆卸下来，使之与多肽链分离，再用带放射性的重组液与这种多肽链在一定条件下重组，将金属部分进行重心组装而后标记。例如，用邻菲啰啉和氧或尿素可将MoFe蛋白中的P-cluster和FeMoCo部分或全部拆卸下来而得到不全蛋白（apo-protein），再用含99Mo、Fe、S的重组液与apo-protein重新组装金属原子簇，从而使重组的MoFe蛋白带上99Mo的标记。

当前24页，总共48页。当前25页，总共48页。*棕色固氮菌(Azotobactervinelandii)野生型固氮菌含钼固氮酶的基本结构固氮酶是一种由两种组分蛋白组成的金属酶。棕色固氮菌含钼固氮酶由铁（Fe）蛋白（Av2）和钼铁（MoFe）蛋白（Av1）。

Av2Av1γ=γsubunit;α,β=α,βsubunit,respectivelyFe4S4=4FeclusterM=FeMoco;P=P-cluster

电子的传递路线为：Av2伴随MgATP水解，通过其[4Fe-4S]簇将电子传至Av1的P-cluster,然后至底物还原中心——FeMoco。当前26页，总共48页。Av2为两个相同亚单位组成的2聚体，含个[4Fe-4S]簇。Av1则为两种亚单位组成的４聚体，分子量位220－240KD，含一对FeMoco[Mo1Fe7S9.homocitrate]和两个P-cluster[Fe8S7]。FeMoco(铁钼辅因子)当前27页，总共48页。P-cluster(两种氧还状态)当前28页，总共48页。金属硫蛋白（Metallothprtein，MT）是一种分子量较小，半胱氨酸含量高，热稳定且与金属离子有较高亲和力的蛋白质。MT在调节动物体内微量元素的代谢以及重金属离子的贮存与解毒等方面具有重要的生理意义。对于金属硫蛋白还可以用放射性银（110mAg）通过置换反应进行标记，从而测定其含量。

当前29页，总共48页。2、生物合成标记法化学标记法是标记已合成的蛋白质，而生物合成标记法则是在蛋白质合成过程中引入标记原子。主要有体内和体外两种标记方法。（1）体内标记法（invivo）给机体一个合适的放射性前体（主要为氨基酸）或标记化合物，通过体内蛋白质生物合成将标记原子引入。前体或标记化合物给予的方式对于动物有口服、腹腔、皮下、肌肉或静脉注射，而对植物和微生物则采用喷施或加到培养液中引入。常用的同位素有3H、14C、35S以及金属原子（如99Mo等）。前体多采用亮氨酸和赖氨酸，因为它们在多数蛋白质中含量较高，并且在代谢过程中不会转变成其他氨基酸。蛋氨酸在蛋白质中含量虽然不高，但由于它们可用35标记，比放射性较3H标记的氨基酸高且比较便宜，故也常用于生物合成标记。标记前体或化合物的引入量和时程，随使用的生物、标记前提或化合物的放射性强度、代谢通路及问题的性质而定。经常可根据经验或通过预实验确定方案。例如对固氮菌中MoFe蛋白的99Mo标记，只要在培养液中加入1μM（99Mo活性为1mCi）的Na299MoO4可得到活性约10μCi的样品。

当前30页，总共48页。体内标记法的特点：标记蛋白质的性质不会有任何改变，能同时标记多个器官或多种组织的蛋白质。在研究整体代谢方面，体内标记是不可缺少的。但它的应用有其局限性，这是因为：①标记前体或化合物通过道谢通路参加蛋白质，由于代谢库的稀释作用，供细胞合成蛋白质所用的标记前体或化合物的比放射性降低，并且难以测定；②代谢库本身有随代谢速率而变，故难以估计；③放射性物质用量大，既造成浪费又易造成污染。（2）体外标记法（invitro）体外标记法主要是借助细胞培养技术，把标记前体或化合物加入到培养液中，细胞通过生物合成而完成标记的方式。一般多用氨基酸或有机离子作为标记物，故他们很容易穿古过细胞膜。与体内标记相比，体外标记的最大优点是可以精确控制温度、pH、离子强度等环境因素。同时，可对不同组织或器官以及不同生长时期的细胞进行标记。

当前31页，总共48页。二、标记蛋白(多肽)的分离技术不论采用前述中的任何标记方法，得到的产物均是各种物质的混合物，因此需要进行分离和纯化。根据被分离物质的分子量，电荷等物理性质及状态的不同，可采用吸附与分配层析、离子交换层析、凝胶层析、素和层析、电泳、超速离心、色谱等技术进行分离。下面着重介绍以125I标记胰岛素时，所得各种混合物的分离技术。用125I标记胰岛素时，混合物主要包括：

1、未标记胰岛素；

2、四种单碘标记胰岛素；

3、双碘及双取代胰岛素；

4、损伤而未被标记的胰岛素；

5、损伤的标记胰岛素；

6、游离的无机盐离子，如125I-；

7、其他（如氧化剂或酶及其降解产物等）。分离纯化常用的方法主要有：当前32页，总共48页。1、分子筛法

单碘胰岛素分子中的Tyr酚环羟基邻位上的氢原子被一个碘原子置换后，酚羟基的pK值从10.1下降到8.6，被两个碘原子置换，pK值降至6.8。在pH8.6时，原型胰岛素所带的净电荷为单碘胰岛素的一半，pH为6.8时，则差别更大。根据在相同pH时，碘化胰岛素所带静电荷不同于原型胰岛素的原理，有人用离子交换层析，或聚丙烯酰胺凝胶电泳法将标记胰岛素和未标记胰岛素分开。2、离子交换法

用DEAE-SephadexA25，AE纤维素，AmberliteIRA-400阴离子交换树脂，采用梯度洗脱或改变洗脱液离子强度或pH等方法，可将未标记胰岛素、标记胰岛素（包括单碘、双碘胰岛素）、双取代或双碘胰岛素逐一洗脱下来。但是此法并不能分离碘化位置不同的单碘胰岛素。当前33页，总共48页。当前34页，总共48页。3、聚丙烯酰胺凝胶电泳法

此法首先于1959年由Omstein和Darris报道。由于其操作简便，仪器简单，分辨率高，而被广泛应用于生物化学及分子生物学研究。1974年被用于碘化胰岛素的分离，此后不断得到改进。此法能将标记胰岛素与未标记胰岛素，损伤碎片及游离125I-等无机盐分开，还可将单碘A14和A19，双碘胰岛素等分开。聚丙烯酰胺是由95%的丙烯酰胺和5%双甲叉丙烯酰胺经过硫酸铵活化聚合而成。电泳过程中，由于电荷效应和分子筛效应的差别，Rf值不同，使标记混合物中各种成分能得到分离，A14和A19单碘胰岛素虽然都标记一个125I-，但亦能被分开；确切机理尚不清楚。B16和B26单碘胰岛素与A19标记物Rf值相同，不能分开。无机盐（包括125I-），在此系统中泳动最快，在指示染料带之前，能满意除去。由此得到的A14和A19单碘胰岛素质架期可达6个月。其他如等电聚焦法亦可获得较纯的A14和A19单碘标记物，但方法较复杂，仪器和试剂要求教高，不尽实用。当前35页，总共48页。当前36页，总共48页。4、聚丙烯酰胺凝胶电泳加QAE阴离子交换层析

单独采用以上任意一种方法，多不能达到将B16和B26单碘标记物分离出来的目的。国外近年采用聚丙烯酰胺凝胶电泳加QAE阴离子交换层析的方法，得到四种单碘胰岛素（图7－8）。5、反向高效液相层析（RP-HPLC）

近年来，采用反向高效液相层析（RP-HPLC）制备柱分离胰岛素标记物已有报道，发现有较大优点。如：省时、效率高、成本低、分离完全、能得到高比放射性高生物活性的四种单碘胰岛素（图7－9、10）。当前37页，总共48页。当前38页，总共48页。当前39页，总共48页。三、标记蛋白(多肽)的分析方法由于在“一”中，利用各种标记方法所得的标记蛋白质均非单一，而是多种蛋白的混合物。为了探明某种特定蛋白质的结构和功能，一方面要建立分离方法，另一方面要建立有效的分析手段。1、抗原—抗体放射性免疫分析

这种分析方法是利用抗原和抗体反应的特异性，在蛋白质混合物中加入特异的抗体，形成抗原-抗体复合物，从而检测和定量蛋白质混合物中的目的抗原。通过与蛋白质放射性标记及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳相结合，这种分析方法可检测出低至100pg的放射性标记蛋白。

当前40页，总共48页。2、凝胶电泳和放射自显影分析标记蛋白质电泳谱的分析，大致可分为放射性计数和放射照相两法。前者指用放射性探测器直接定量测定凝胶中的放射性强度；放射照相乃通过射线或间接通过光子的作用使胶片感光成像，然后用显微密度计定量测量。（1）放射性计数法①分段计数常用的方法是电泳后将乳胶切成小片，分段计数。此法须注意两个问题：A、不要等厚度随机切片，应先染色，选择性切下斑点，以免造成两个宽度相当、强度相等的峰的计数率很不相同；B、因凝胶切片有一定厚度，样品包埋其中，闪烁体渗入能力有限，因而相当部分的放射性不能回收。使凝胶完全溶解，把样品从凝胶中洗脱出来，或将闪烁体掺和到凝胶中去，可以解决分段计数放射性回收问题。当前41页，总共48页。聚丙烯酰胺凝胶可溶于30%H2O2，每片凝胶（厚0.5～1cm）加1ml30%H2O2，60℃保温至完全溶解，再加合适的闪烁液计数。如果先加0.2ml60%过氯酸，再加0.4ml30%H2O2，则凝胶更易溶解。琼脂糖凝胶在1NHCl，90℃下很易溶解。凝胶在含6M尿素的1%SDS溶液中，37℃，保温40小时，蛋白质可被洗脱出来。其缺点是洗脱不完全，且不确定，放射性稀释也无法避免。闪烁体可掺和到凝胶中（方法见下文）。掺有闪烁体的凝胶片直接放在计数杯中，无需加闪烁液即可计数。

当前42页，总共48页。②整胶扫描薄层层析和纸电泳后，分离图谱上放射性计数管广泛采用钟罩或计数管扫描，但后来为高灵敏液体闪烁计数技术取代。现在，通过改良扫描装置，提高钟罩流气或计数器的灵敏度，放射性扫描的灵敏度已与液体闪烁计数法相当，足以对聚丙烯酰胺胶板进行定量探测。西德Berthold公司生产的线形分析器，可通过钟罩式计数管的移动（移动速度取决于放射性强度）逐行扫描整块凝胶。它不仅可以象普通流气式计数器那样计数放射性脉冲，还可以定出脉冲发射点在阳极丝上的出现和到达末端的传播时间完成的。每行同时处于线形分析器计数管的开放式入射窗（约25×1.5cm）下，记录脉冲的阳极丝与入射窗长轴平行。同时记录位于该行上所有放射性的位置。这种线形分析器20min可记录只有250dpm3H或50dpm14C的放射性斑点。此扫描仪配有专有计算机，可输入整块凝胶的测量程序（扫描行距等），并能做数据处理，包括对各行的比较。这种扫描装置具有操作简便，灵敏度高，分辨力好的优点。

当前43页，总共48页。（2）放射照相法①直接放射自显影电泳凝胶板与感光胶片（X线胶片）直接接触，凝胶中的放射性标记蛋白质发生的射线使胶片溴化银活化成银离子。直接放射自显影适用于检测发射高能β粒子或X射线的同位素，例如14C、35S、32P和125I，而且只有当样品中的放射性强度足以形成有效潜影时，才能采用。高能β粒子的放射自显影可以直接在凝胶上进行，若为14C则宜先将凝胶干燥，以减少自吸收。凝胶厚度不要超过0.4mm，否则底层的β粒子不能到达X线胶片。32P曝光数小时即可，14C须几天或几周。短时间曝光可在室温下进行，长时间曝光则应在-70℃完成，以减少样品扩散。干燥凝胶勿须低温曝光。直接放射自显影的灵敏度较高，曝光24小时能检测到6000dpm的4C或35S，575dpm的32P，1600dpm的125I斑点。

当前44页，总共48页。②间接放射自显影

32P和

125I发射的高能β粒子或X射线，不仅可直接使X线胶片感光，也能穿过胶片。若在胶片后面放置增感屏，这些穿透胶片的射线在荧光屏上可产生光子，光子也能使胶片感光，于是使原来的信号增强，此即所谓间接放射自显影。为到达最佳效果，胶片需预闪并且在-70℃曝光。胶片预闪指在曝光前使胶片预曝光。预闪可以普通电子闪光灯做光源，曝光距离为70～100cm，曝光时间须小于1mS。预闪胶片不宜保存，应临用前预闪。将预闪胶片的雾化面（预闪时对着光源的那一面）贴着增感屏，干燥凝胶放在胶片另一侧，使成为凝胶：胶片：增感屏“三合板”。也可用两块增感屏，即增感屏：凝胶：胶片：增感屏“四合板”。外面加玻板后捆扎，或用X线胶片匣夹起来，在-70℃曝光。由于β粒子或γ射线的轨迹并不总是与凝胶垂直，而且X线胶片位于增感屏与凝胶之间，增感屏的使用可以减低影像分辨能力，不过问题并不严重。从表3可以看出，间接放射自显影的灵敏度比直接放射自显影有明显提高。当前45页，总共48页。③荧光照相（参考《重组DNA的原理与方法》P-67）放射自显影不能用于3H和低水平14C、35S的分析。为解决此问题，1974年Bonner和Laskey创造了荧光照相术。把荧光体引入凝胶，使与标记蛋白质直接接触，β粒子通过与临近的荧光体相互作用将能量转变为光能，而使胶片感光成像。基本步骤为：电泳→固定→掺入荧光体→干燥→曝光。现今可选用的荧光体有：PPO、水杨酸钠