高中生物选修基因工程的基本操作程序

高中生物选修基因工程的基本操作程序第一页，共三十五页，2022年，8月28日补：原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子终止子RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。

转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。

转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。第二页，共三十五页，2022年，8月28日与RNA聚合酶结合位点AGGUCACGUCGAGGTCACGTCGTCCAGTGCAGCRNA聚合酶RNA聚合酶RNA聚合酶第三页，共三十五页，2022年，8月28日①不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质。：能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质编码区非编码区原核细胞的基因结构②有调控遗传信息表达的核苷酸序列，在该序列中，最重要的是位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。启动子第四页，共三十五页，2022年，8月28日真核细胞的基因结构一个典型的真核细胞基因结构示意图编码区含有能够编码蛋白质的序列(外显子)不能编码蛋白质的插入序列(内含子)真核生物的结构基因是断裂基因非编码区非编码区编码区与RNA聚合酶结合位点外显子内含子12345第五页，共三十五页，2022年，8月28日真核细胞的基因结构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的RNA

聚合酶结合位点。非编码序列：包括非编码区和内含子第六页，共三十五页，2022年，8月28日非编码区非编码区编码区与RNA聚合酶结合位点外显子内含子12345加工转录mRNA前体成熟mRNA加工第七页，共三十五页，2022年，8月28日原核细胞真核细胞不同点编码区是_____的编码区是间隔的、_____的相同点都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较思考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续不连续编码区非编码第八页，共三十五页，2022年，8月28日基因工程基本操作的四个步骤1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定第九页，共三十五页，2022年，8月28日一、目的基因的获取1、目的基因主要是指______________________编码蛋白质的结构基因2、获取目的基因的常用方法有哪些?（1）从基因文库中获取（2）利用PCR技术扩增（3）人工合成请阅读P9第一和二两段第十页，共三十五页，2022年，8月28日(一)从基因文库中获取目的基因

将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库基因文库

基因组文库部分基因文库（如:cDNA文库）1.基因文库第十一页，共三十五页，2022年，8月28日基因组文库与部分基因文库的关系第十二页，共三十五页，2022年，8月28日2.基因文库的构建方法①鸟枪法：供体细胞中的DNA许多DNA片段运载体限制酶与载体连接载入受体细胞产生特定性状导入目的基因分离(直接分离法)(一)从基因文库中获取目的基因第十三页，共三十五页，2022年，8月28日②反转录法：

以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。目的基因的mRNA杂交双链(单链RNA/单链DNA)单链DNA反转录酶核酸酶H2.基因文库的构建方法DNA聚合酶双链DNA(目的基因)第十四页，共三十五页，2022年，8月28日求异思维你能推测出由mRNA反转录形成cDNA的过程大致分为哪些步骤吗？反转录酶既可以利用DNA又可以利用RNA作为模板合成与之互补的DNA链。像其他DNA聚合酶一样，反转录酶也以5′→3′方向合成DNAcDNA合成过程是：第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的DNA。第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。第十五页，共三十五页，2022年，8月28日③根据已知的氨基酸序列合成DNA法：

根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成2.基因文库的构建方法第十六页，共三十五页，2022年，8月28日上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？优点缺点鸟枪法反转录法根据已知氨基酸合成DNA法操作简便广泛使用工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因专一性强操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高专一性最强仅限于合成核苷酸对较少的简单基因思考:为什么要构建基因文库?直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗?第十七页，共三十五页，2022年，8月28日(二)利用PCR技术扩增目的基因第十八页，共三十五页，2022年，8月28日①概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术③条件：_______________________、

_______________、___________(做启动子)、___________.前提条件：②原理：__________④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）⑤结果：选修1P60聚合酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸一对引物DNA聚合酶指数2n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增(二)利用PCR技术扩增目的基因第十九页，共三十五页，2022年，8月28日b、PCR（聚合酶链式反应）技术扩增由穆里斯等人于1988年发明，并于1993年获得若贝尔化学奖。PCR反应的过程：（变性、退火、延伸、多次重复）变性退火延伸结果：双链DNA分子数为2n可获取大量目的基因第二十页，共三十五页，2022年，8月28日⑥过程：a、DNA变性（90℃-94℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成___________b、退火（复性25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链第二十一页，共三十五页，2022年，8月28日二、基因表达载体的构建寻根问底将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物,不好检测与筛选,同时也无法增强目的基因的表达水平,也不能确定目的基因产物的存在部位。构建基因表达载体的目的a、使目的基因在受体细胞中稳定遗传的b、使目的基因复制并遗传给下一代c、同时使目的基因能表达和发挥作用。第二十二页，共三十五页，2022年，8月28日1.用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出____________。2.用_____________切断目的基因，使其产生_________________。(二)基因表达载体的构建——

核心3.将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量___________，形成了一个重组

DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶的黏性末端切口DNA连接酶相同第二十三页，共三十五页，2022年，8月28日质粒DNA分子限制酶处理一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）——

核心同一种(二)基因表达载体的构建4.过程:第二十四页，共三十五页，2022年，8月28日5.基因表达载体的组成：复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因它们有什么作用？第二十五页，共三十五页，2022年，8月28日(三)将目的基因导入受体细胞转化——方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——感受态细胞目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程受体细胞稳定表达阅读掌握（P12--13）第二十六页，共三十五页，2022年，8月28日根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理，你能分析出农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物的原因吗？若想将一个抗病基因导入单子叶植物，如小麦，从理论上说，你应该如何做？思考：原因：研究证明，主要酚类诱导物为乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香酮，这些物质主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中，这也是单子叶植物不易被根瘤农杆菌侵染的原因。如果想将一个抗病毒基因转入小麦，也可以用农杆菌，但要注意两点：①要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；②要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。第二十七页，共三十五页，2022年，8月28日(四)目的基因的检测与鉴定——检查是否成功检测—鉴定——①检测转基因生物染色体的DNA

上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法——方法——方法——DNA分子杂交分子杂交（注意与上不同之处）抗原抗体杂交第二十八页，共三十五页，2022年，8月28日第二十九页，共三十五页，2022年，8月28日四、目的基因的检测和鉴定

细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。无表达产物无表达产物有表达产物无表达产物第三十页，共三十五页，2022年，8月28日四、目的基因的检测和鉴定多细胞生物的检测，将每个受体细胞单独培养并诱导发育成完整个体，检测这些个体是否摄入目的基因，摄入的基因是否表达（是否表现出相应的性状）。淘汰无变化的个体，保留有相应变化的个体进一步培养、研究。例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。（从个体水平鉴定）第三十一页，共三十五页，2022年，8月28日1）以下说法正确的是（）

A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列

B、质粒是基因工程中唯一的运载体

C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接

D、基因控制的性状都能在后代表现出来C练习第三十二页，共三十五页，2022年，8月28日2）有关基因工程的叙述中，错误的是（）

A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来

B、限制性内切酶用于