“体外诊断试剂研发全流程管理培训课程-分析性能评价”精彩回顾之100问

2/2“体外诊断试剂研发全流程管理培训课程—分析性能评价”精彩回顾之50问2022年11月17日，由中国医学装备协会应用评价分会主办，北京水木济衡生物技术有限公司承办的《体外诊断试剂研发全流程管理培训课》第三期分析性能评价课程正式开课，培训课程持续三天，邀请了多位行业资深专家授课，吸引了上百家企业参加。培训的最后一天，设置了讨论环节，多位专家就学员提出的问题进行了详细的解答，现将部分问题及专家回复整理如下。01不同项目的医学决定水平都有哪些渠道和方式可以获得?专家答复：医学决定水平（Medicinedecidelevel，MDL）是临床医生在诊断和治疗疾病时应该掌握和使用的数据，它是不同于参考值的另一些限值，临床医生可以通过观察测定值是否高于或低于这些限值，可在疾病诊断中起排除或确认的作用，或对某些疾病进行分级或分类，或对预后作出估计，以提示医师在临床上应采取何种处理方式，如进一步进行某一方面的检查，或决定采取某种治疗措施等等。医学决定水平与参考值有区别。参考值来源于大量的健康人群中有关实验测定数据，并根据健康人群中不同年龄、性别分别进行统计分析，得到了绝大多数人群中数据的分布范围，并以此确定参考范围。而医学决定水平是来源于大量的临床患者数据的观察和积累，用于确定疾病的发生发展和变化情况，并针对这些情况对患者进行诊断和治疗。例如，血清白蛋白的参考范围为35～55g/L，可将它分为3个医学决定水平，第1级决定水平为20g/L，肝病患者白蛋白低于20g/L时说明预后严重；第2级决定水平为35g/L，为检查所有低白蛋白的界限值；第3级决定水平为57g/L，稍高于参考范围上限，＞57g/L应考虑脱水的可能性。再例如，ALT的参考范围为5～40U/L，但其医学决定水平有3个，第1个决定水平是300U/L，＞300U/L，通常与急性肝细胞损伤有关，如病毒性肝炎、中毒性肝炎、肝性休克等，＜300U/L，往往是酒精性肝炎，其他如传染性单核细胞增多症、多肌炎等；第2个决定水平是60U/L，此值比参考值上限高50%左右，一般当ALT测定值在40～60U/L之间时，并不能确定ALT的升高是否属于病理性改变，许多不很健康的肥胖者，其ALT值就通常浮动在这范围之内，只有当ALT值>60U/L时，才可明确诊断为肝细胞损伤，所以它是一个确认值；ALT的第3个医学决定水平是20U/L，这是一个排除值，低于此值则可排除许多与ALT升高有关的疾病。医学决定水平的界定需要进行大量的临床观察和研究，是一项十分复杂的工作。目前，临床常用检验项目的医学决定水平都能从各种医学参考书籍、诊疗指南、专家共识查到。例如，《中国临床血脂检测指南》中对我国普通人群血脂水平分层标准如下：02EP文件的获得途径，如何及时得知相关文件和法规是否更新?有没有专门分析学习EP文件的平台?专家答复：EP文件可从CLSI官网（/）上查询和购买。另外，国内发布的一些性能评价相关的标准、指导原则、参考书籍在基本原则上也与CLSI的EP文件一致，具有很强的参考价值。现对这些文件汇总如下：03产品技术要求里面的准确度项目，是否使用正确度更为合适？现在很多行业标准写得都是准确度。专家答复：准确度和正确度是两个不同的术语。测量正确度是评价均匀样品的一系列测量结果中系统测量误差的性能特征。正确度是一个定性概念，但测量偏倚可以被评估。评估偏倚需有可用于确定被测量参考量值的适当参考物质或参考测量程序。准确度是一个测得量值与被测量的真量值间的差异，这个测量误差包括由测量偏倚估计的系统测量误差分量和由标准差估计的随机测量误分量，准确度是正确度和精密度的组合。一个测量结果的不准确度可以用测量不确定度来表达（以前用总误差表达）。由于临床实验室检验工作特点，一般情况下我们只对每个样品只做1次就发出报告，因此，我们报告的结果不是均值，只是一个分析中的一个抽样值，因此考察方法或试剂的准确度非常重要。目前，在定量测定试剂盒的行业标准制修订过程中，大多数情况下用了“准确度”这一指标，试验方法如下：04常规定量免疫检测产品对于指尖血(非抗凝)的性能评价方法有何建议呢？因为它很快就凝固了，操作起来很困难专家答复：常规定量免疫检测产品如果还适用于指尖血这一样本类型，应采用合理方法评价这一样本类型的适用性。对具有可比性的样本类型，可选择具有统计学意义数量的样本进行样本一致性的同源比对研究；对于不具有可比性的样本类型，应对每种样本类型分别进行分析性能评估。以自测用血糖监测系统举例，其适用的样本类型如果是指尖、手掌、上臂等部位的毛细管全血，如不同采样部位的毛细血管全血样本具有可比性，应选择具有统计学意义数量的样本（手掌、上臂）与指尖血样本进行一致性的同源比对研究，明确分析结果之间是否存在显著差异，存在的差异是否可被接受。另外，如在分析性能中采用静脉全血进行替代性研究，应说明采用替代样本的原因并进行不同采样部位全血与静脉全血的等效性研究。05产品研发过程中，是否可以使用获得CE认证但未获国内注册证的已上市产品，对使用的样本进行性质及量值的确定？如使用CE认证产品（国内未获批）对收集的临床样本进行检测并确认浓度后，进行最低检测限的研究。专家答复：研发阶段，作为对照方法的试剂应为成熟可靠的试剂，一般应当采用已上市试剂进行研究。如确无已上市试剂，可以采用未上市但已定型的试剂进行研究。06病原菌抗体检测试剂盒，国内无上市同类定量产品，在最低检出限、阳性判断值等性能研究中，是否可采用CE认证的，选用针对不同抗原的抗体检测试剂盒对样本进行定值。专家答复：对于病原菌抗体检测试剂的性能评价，所用到的阳性样本、阴性样本，应有明确的临床诊断“金标准”方法或其他成熟方法对这些样本进行鉴定，或者这些样本应有准确临床诊断信息。07对于国家标准品的准确度检验，如果国家标准品说明书中的要求和产品适用的推荐性标准（YY/T）不一致，是否应该优先参考国家标准品说明书中的要求？专家答复：一般不会出现国家标准品说明书与行业标准不一致的情况。如果确实出现不一致的情况，优先参考国家标准品说明书中的要求，并及时与标委会联系反馈。08基于microRNA的测序检测，没有公认的金标准，现有标准物质不能监测整个试验过程（不能覆盖提取实验，只能以RNA对测序实验进行参考），如何判定其定量性能？专家答复：这种情况下，企业应先建立自己的全过程监控标准，确定自己的定量性能。过程中注意：提取效率验证一般采用临床样本进行，可以通过梯度稀释及对照等方式，计算提取效率；microRNA在外周血中主要存在于外泌体中，外泌体为细胞膜结构，一般认为对提取过程的影响较小，且现在无人工模拟外泌体的方法，一般均将microRNA直接混入外周血来制备企业参考品。09当样本类型为血清、血浆、静脉全血与指尖全血时，指尖全血是否需要单独进行分析性能评估，如精密度，分析灵敏度等专家答复：同问题4的答复。10当企业无法获得大量正常人血清的情况下，可以用其他的血清做实验吗？专家答复：体外诊断试剂用于对人体样本(血液、体液、细胞、组织样本等)进行检测的，因此在产品研发阶段分析性能评价、企业参考品制备、产品校准品和质控品制备生产、阳性对照品和阴性对照品制备生产、国家标准物质研制等过程大量使用临床样本。这些临床样本，大部分不是特意采集的患者样本，是实验室废弃样本，不会对患者产生风险，不干预患者诊疗，也不会造成人类遗传信息泄露。但是在目前国家《献血法》、《医疗废弃物管理条例》、《人类遗传资源管理条例》、《人类遗传资源采集、收集、买卖、出口、出境审批行政许可事项服务指南》、《实验室生物安全通用要求》等法规规定下，实验室出于生物安全、患者知情等因素，一般不愿意提供给企业，血源性原料获得存在非常大的困难。为了振兴我国的生物医药产业和医疗器械产业，确保生产、研发对血源性原料的供给，为此相关IVD行业协会多次建议国家出台相关法规，推动血源合法化。11咨询问题老师讲的精密度建立过程中需要用的3个临床样本和3个质控品，可以只用3个临床样本吗？或者质控品是否可以减少浓度点？专家答复精密度确认过程中，对于测量范围确定，不同浓度水平精密度一致或相差不大的测量系统，可以减少样本数量，3个临床样本；但对不同浓度水平精密度相差较大（低水平精密度差一些，高水平精密度好一些）的测量系统，样本数量不建议少，EP05-A3上是至少5个水平；上述2种情况，在进行精密度评价时，均需运行室内质控程序来保证测量系统的准确度和稳定性，质控品可以减少至2个浓度水平（低、高两个水平）。12咨询问题是否需要研究不同型别？专家答复在研发初期还不能判断样本的类型是否会影响精密度时，建议进行考察；优先考察临床患者样本，临床患者样本不满足要求时可对其他可替代的产品进行考察。13咨询问题定性产品的精密性研究，选择的3个水平样本（最低检出限水平、阳性水平、阴性），其中阴性满足C50-20%浓度要求、阳性水平样本满足C50+20%浓度要求且高于最低检出限水平。此时，是否可以不再重复做临界值水平的精密性研究（不再分别重复进行40次检测）。专家答复参考定性检测体外诊断试剂分析性能评估注册审查指导原则（2022年第36号）中3.2条款：3.2临界值水平的精密度研究（如适用）除上述精密度研究外，建议申请人对申报产品的临界值进行确定，并采用该浓度/水平样本进行精密度研究。此处所述临界值水平不同于通过ROC曲线等方法确定的阳性判断值。理想情况下，临界值浓度水平，即为多次重复试验时，50%的结果为阴性，50%的结果为阳性浓度水平，在本文以C50表示。如果临界值水平可以确定，仍建议对其进行精密度研究（40次重复性检测）。14咨询问题下述精密性研究方案是否可行？3个水平样本（最低检出限水平、中强浓度水平、阴性）使用2个批次试剂，分别进行重复性试验和再现性试验。重复性实验方案：3个水平样本，使用每个批次试剂分别重复2次检测，进行20天，共使用2个批次试剂。（每个水平样本检测数量：2次重复检测×2批试剂×20天）再现性实验方案：分别在3个环境下对3个水平样本进行实验，每个批次试剂分别重复5次检测，进行5天，共使用2个批次试剂。（每个水平样本每个批次试剂检测数量：5次重复检测×3个环境×5天）。专家答复：重复性实验中数据分析时建议用1个批次试剂就可以满足研究要求，若要按定量产品中单点精密度来评价的话，用1个批次试剂，增加1个分析批（2次重复检测）。再现性实验方案中建议增加重复测量次数，即由5次增加到8次（参考精密度评价研究时定性产品的重复测量次数需达到40次及以上），这样每个环境下各水平样本的检测次数也可满足统计要求。15咨询问题除上述精密性实验外，是否还需要再进行中间精密度？专家答复：上述两种方案的测量条件已经是中间精密度的其中一种（不同天、不同试剂批号、不同环境等），如果发现有其他影响较大的因素则可进行相关的条件改变，进行相关的精密度研究。16咨询问题精密度的3批试剂批间差设计方案有建议吗？专家答复：建议由同一个操作人员在同一台仪器上按相同的测量程序进行检测，每个批号试剂用配套校准品校准后，测量同一个质控品或临床样本。检测可不在同一时间，如环境对检测影响较大，建议3批试剂检测期间控制环境条件尽量保持一致。17咨询问题：一般法规中对精密度的要求如下，就是这个n≥20一般指的是什么意思呢，每天检测的每份样本要检测20次？还是需要不同的20个阴性样本、20个临界阳性样本、20个中阳样本？专家答复：n≥20指的是检测20次或有20个测量结果；不是需要不同的20个阴性样本、20个临阳样本、20个中阳样本。待评价样本至少有3个水平：阴性样本、临阳样本、中阳样本，各只有1个，样本需足量满足精密度实验需求。18咨询问题精密度中自由度和s倍数对应表中，怎么选择合适的s倍数和自由度？专家答复：一般取95%的置信区间，有效自由度无穷大时，s的倍数正好是1.96。我们也可以通过查表得到：95%的置信区间，s倍数为2.009的时候，有效自由度为50。在实际工作中，我们不可能去做无穷多次，可以假设为s倍数为2时，对应的有效自由度为50。19咨询问题精密度评价，重复性、中间精密度、再现性，三个都需要评估吗？按照EP05-A3的20×2×2模型进行评估，是否能满足指导原则的要求？专家答复：指导原则要求应根据各测量条件对检测结果影响程度的分析，设计合理的精密度试验方案进行评价，包括重复性、实验室内精密度、实验室间精密度和批间（lot-to-lot）精密度。按照EP05-A3的20×2×2模型进行评估，每批两个结果（４０对）间的差异，就是该样品批内不精密度的具体表现，根据这个结果计算出来的不精密度是改变了重复性条件的批内不精密度。20×2×2模型考虑了体外诊断试剂在医学实验室使用过程中的分析批、时间等影响因素，归类为中间精密度的一种情况。20咨询问题对于定性试剂的精密度测试实验怎么设计呢？专家答复：参考《定性检测体外诊断试剂分析性能评估注册审查指导原则》。应根据各测量条件对检测结果影响程度的分析，设计合理的精密度试验方案进行评价，包括重复性、实验室内精密度、实验室间精密度和批间（lot-to-lot）精密度。应选择包括最低检出限水平、中强浓度水平、阴性的至少三个分析物浓度水平样本进行精密度研究。如适用，还应进行临界值水平的精密度研究。21：咨询问题正确度评价，参考物质、比对试验、回收试验这三种方式选择上有优先级吗？有些项目，尽管有有证参考物质，但是购买不到，可否采用方法学比对的方式？专家答复正确度评价有三种方法：第一种方法是分析具有被测量参考量值的适当参考物质；第二种方法是基于用患者样品进行方法学比对并估计偏倚，此种偏倚实际上是两种方法之间的系统误差；考虑到前两种评价方法的可获得性有所限制，因此在有些情况下，可采用第三种方法即回收试验，但要注意的是回收试验评价的不是真正的“偏倚”。原则上，有可用的参考物质的话，优先采用参考物质进行正确度评价，这种方法也是操作起来最简单、最便捷的方法。当参考物质不能获得时，可采用比对试验。22：咨询问题当企业无法获得大量人血清的情况下，可以用其他的血清做实验吗？有推荐的可购买的血清吗？专家答复比对试验应尽可能使用临床样品。若样品量缺少不够用于重复测定或测量区间的某些样品难以获得时，可通过混合、添加、稀释等办法进行处理。处理过程可能会引起样品互换性问题，因此使用处理过的样品应进行标注和记录，建议处理过的样品不超过样品总数的20％。23：咨询问题不同的比对试验方案参考的法规或方法不同，结果不同，那我们做出选择时，有哪些较好的判断依据没有?比如什么情况下选择多少例样本，如何判断等?专家答复正如培训时老师讲到，比对试验可参考的文件如下。在进行比对试验，我们考虑的因素包括：怎样选择目标检测系统（参比方法）？选择多少份标本n＝？选择标本的浓度或浓度范围是多少？每天检测多少批？批间间隔时间？每批检测标本数及检测顺序？共需多少工作日？数据怎样处理？偏倚的判断标准怎样设置？不接受的项目怎样整改？不接受的项目整改后怎样验证？由于参考的文件不同，以上考虑因素也有差异，因此评价结果或结论也有可能不同。我们一定要基于我们的评价目的（建立性能指标？确认？验证？），选择合适的、最新的、法规认可的方法。目前，行业内参考较多的是CLSIEP09cMeasurementProcedureComparisonandBiasEstimationUsingPatientSamples（用患者样品进行测量方法比对及偏倚估计，2018年）。CLSIEP09c要求样本数量不少于100例。24：咨询问题OLR、WLS、Deming、Passing-Bablok四种回归统计方式是否可提供经典案例分析举例，以便更好的理解和应用。或者有没有专门医学统计学与产品结合的分析应用的学习平台，求讲解和推荐。专家答复CLSIEP09c的附录给出了这4种模型的公式和案例，另外YY/T1789.2-2021《体外诊断检验系统性能评价方法第2部分：正确度》的附录也给出了这4种回归模型的示例，建议大家仔细学习。25：咨询问题待评方法和参比方法统计分析时，Deming和passing-bablok两种回归方法的具体区别是什么？专家答复OLR对数据的分布、等方差性等有较为严格的要求，要求因变量与自变量关系为线性、误差服从均数为0的正态分布且方差相等、各观测独立、x无误差等。在医学检验和IVD实际工作中，常常需要比较两种仪器、两种方法或两个不同实验室的测量结果是否相同，由于因变量（y）和自变量（x）都包含测量误差（随机变量），不符合最小二乘回归的假设条件。因此Deming回归和passing-bablok回归虽然是两种比较小众的回归方法，却在我们这个领域用的比较多。比对试验，一般情况下，方法间差值混合变化时，可选择Deming回归或Passing-bablok回归。Deming回归在建立y对x的回归方程中，同时考虑x的残差最小和y的残差最小。passing-bablok，相当于把任意的两个点，计算其斜率，如果有4个点，就能计算出6个点的斜率，Passing-bablok回归线的斜率为所有这些斜率的中位数。比较而言，Deming方法有时不能消除一些差异变化较大数据点的影响，Passing-bablok为非参数方法，统计更宽松，不考虑随机误差有多大。强调的是EP09c要求须先通过散点图、偏差图、柱状图等方法从不同角度联合评价，从而选择最佳回归模型进行拟合分析。26：咨询问题r是最小二乘法得到的还是最适合方程得到的呢？专家答复方法学比较，在进行回归统计的时候，往往先计算相关系数（r）。相关系数计算公示如下，r反映了组成这条最小二乘回归直线上所有实验点对于线的紧密程度。r值越大，说明两个方法检测患者样品检测结果间关系密切（密切≠相等，r不是x和y方法结果一致的指标），这时候可以进行回归统计了解两个方法检测数据间的数学关系了。27：咨询问题方法比对中，分析质量目标、总误差分析目标、TEa等的设定依据有哪些？专家答复1999年斯德哥尔摩会议提出了分析质量指标设定的几种原则和方法：（1）评估分析性能对临床决定的影响；（2）检验项目的生物学变异；（3）已发表的专业建议；（4）性能目标由监督机构、或室间质量评估计划组织者设定；（5）现有技术水平能达到的性能水平。2014年米兰会议重新修订了分析性能指标的“共识声明（Consensusstatement）”，由原来的五个等级简化为三个等级，并且增加了注释。​国内一些标准，例如WS/T403-2012《临床生物化学检验常规项目分析质量指标》，还有医药行业标准（YY标准）中的一些产品标准，都给出了常规项目的变异系数、偏倚、总误差要求。28：咨询问题方法学比对实验中，离群值剔除的标准是什么？专家答复离群值产生有两种来源:一是技术错误造成的，即样品错误、测试时的操作错误、仪器故障、计算错误、录入测试结果时的简单书写错误等造成的，这样的离群值可以直接剔除，或剔除后再做实验补数据；第二种来源是不能用技术错误解释的，产生于试验条件、试验方法等因素的偶然偏离，这时就要进行统计处理来决定离群值是保留还是剔除。离群值的取舍对分析结果会产生很大影响，必须谨慎对待，在离群值产生的原因不明之前，不应简单决定其取舍。在做离群值检验时，要预先规定检出离群值个数的上限，若检出的离群值个数超过了这个上限时，对这一组测量应做慎重的研究或处理。EP09c推荐用广义极端学生化偏差(ExtremeStudentizeddeviate,ESD)方法检验离群值，离群值的数量不应超过5%。29：咨询问题利用格拉布斯法(Grubbs)检验法检验离群值时，选用EXCEL编辑的公式和MedCalc软件进行统计分析（选取同样的α值），结果不一致，一般是EXCEL显示有离群值，MedCalc软件显示无离群值，请问这个是什么原因导致的?软件选择界面如下：专家答复格拉布斯法计算公式应该是一样的，可能用软件的时候是选择了右侧检验而excel可能是双侧检验的原因，建议软件也使用双侧检验试一下。30：咨询问题关于数据正态分布的统计判断，S-W和K-S分别参考时机？如果是基于样本量来判断的话，那么在不同样本量分别优先考虑哪种判断方法？专家答复通常W检验是小样本量，医学统计中样本量为8-50时使用W（S-W）检验，样本量大于50时使用D（K-S）检验。不同的统计软件对于W、D检验样本量的使用要求不同，如SAS应该是2000，SPSS可能是5000。本节主要针对参考物质相关问题。31咨询问题国家参考品和国家标准品，对于产品需要执行的强度是不是可以理解为推荐性标准和强制性标准？专家答复：个人理解国家标准品和国家参考品，只要适用，注册检验时都应使用。32咨询问题定性体外诊断试剂产品，已经买到国家标准品，国家标准品附带的说明书中描述不能用于溯源，原因是什么呢？专家答复：国家标准品和国家参考品，主要用途是用于体外诊断试剂质量评价，在原材料选择、制备方法、标定方法、标定结果、定值准确性、量值溯源、稳定性及分装与包装条件等方面都对其有相应的要求。定性试剂国家标准品或参考品，通常由阳性参考品、阴性参考品、检测限参考品及精密性参考品等组成，分别用于对IVD试剂敏感性、特异性、检出限、精密度等性能的评价。计量溯源性目前主要针对定量测定，定性测定目前还无法做到溯源，国家标准品或参考品主要用途还是评价结果的一致性。33咨询问题关于正确度，有国家标准品，但是是人工重组的，和企业的检测系统不匹配，该怎么处理？专家答复：国家标准品说明书的“用途”一栏注明了标准品的来源和适用范围。如确实不适用，建议企业可向注册审评审批部门提交说明，充分详述不适用的理由。34咨询问题定量检测试剂没有标准品，可以用重组抗原或天然抗原做企业标准品吗？需要溯源到哪里？专家答复：这种情况下，可参考ISO17511：2020版模式6“被测量由制造商内部自定义的参考物质定义，没有一级参考物质和有证参考物质，也没有参考测量程序和一致化方案，不能溯源到SI单位”。简单地说，企业要自行建立标准。模式6溯源的终点在于企业自定义的参考物质（m3），被测量由这个参考物质定义。m3通常是一些纯品，例如针对抗原检测，m3往往是纯化的重组抗原，采用重量法或免疫分析方法（p4，制造商选定的测量程序）得到制造商工作校准物。35咨询问题定量体外诊断试剂产品，没有标准品，采用外购化学合成的标准品，需要提供哪些材料，才可以做溯源用呢？专家答复：量值溯源如何做，以及需要提供哪些文件，在ISO17511：2020版有详细要求。36咨询问题产品研制过程中，无国家标准品，采用临床样本制备参考品的注意事项有哪些？具体参考文献有哪些？专家答复：企业参考品的用途是全面评价和确认产品的各项性能，发挥“标尺”、“砝码”作用，是IVD研发、生产及应用全过程中进行产品安全有效性评价的必备核心耗材，因此企业参考品设计时应客观合理，应能充分评价产品的质量，帮助发现产品在设计或者生产中的一些缺陷和问题。采用临床样本制备参考品的注意事项：1）阳性参考品主要评估产品的敏感性，应具有代表性、满足临床样本的分布类型、遗传标记代表性，应包括强阳性参考品、中等阳性参考品、弱阳性参考品，其中应以中等阳性参考品为主。如被测物包括不同的型别及亚型，一般情况下应覆盖；2）阴性参考品主要评估产品的特异性，阴性参考品除了有不含被测物的正常患者样本外，还应设置一定数量的含有可能会产生交叉反应物质的样本，包括分析物的结构类似物、具有同源性序列的核酸片段、易引起相同或相似的临床症状的其他病原体、采样部位正常寄生或易并发的其他微生物等。建议还应设置干扰评价的参考品，如常见的内源性干扰物质、常用药物及其代谢物、样本添加剂等；3）在企业参考品的基质选择上，企业参考品的基质应可能与临床被检样本相同或接近（例如血清、血浆、组织切片）。例如，检测血浆中基因突变的试剂评价参考品的设置应根据血浆样本中突变类型分布、片段长度、浓度等进行模拟；4）企业要建立自己的参考品，并固定化下来。举例来讲，对于定性试剂盒而言，检出限这个指标非常关键，因此检出限参考品的合理设置也就显得尤为重要，但在实际工作中，我们会发现有的企业设置该参考品时不太科学，往往随意选择一个临床的强阳性样本，然后进行倍比稀释，对系列稀释的参考品进行检测，直至检测到结果为阴性，并将上一个稀释度参考品设置为检出限参考品，这样并不能清楚的确定参考品中的被测物的具体浓度（或滴度、效价等），从而也无法保持参考品批次间的一致性。可参考的文献包括相应审评指导原则的要求、国家标准品和参考品的研制相关论文等。37咨询问题体外诊断试剂盒的不同的基因位点的参考品必须都是相同的吗？比如全部都得是来自阳性细胞系或者全部都是阳性病人血样？专家答复：要视情况而定。参考品的原材料应尽可能与临床样本相一致或接近，主要来源于临床样本，但也可来源于永生化细胞系、基因编辑细胞系，甚至也可来自基因工程构建产品、重组质粒等。一般情况下建议阳性参考品中常见基因突变位点采用临床样本提取的DNA储备液或细胞系作为原料，其他突变位点可采用DNA储备液、细胞系或突变扩增产物模拟样本作为原料。38咨询问题要检测病人中的基因突变位点，尽量用临床样本来进行性能分析，如果临床样本比较难获得可否用带有突变位点的细胞系来作为参考品？专家答复：可以。39咨询问题基因突变位点检测中设置的强阳性参考品中关于强阳应如何定义，浓度如何界定？专家答复：强阳性在突变位点的检测中一般是指突变频率比较高的阳性样本，与临床中患者检测出的群体突变频率相关，没有准确的定义，可以根据不同疾病查阅文献来设定。一般情况是直接选择临床样本，不进行人为稀释。40咨询问题关于流产物组织染色体拷贝数变异检测试剂盒企业参考品建立中，关于微缺失微重复参考品，只要不影响相关疾病诊断，微缺失微重复的DNA区段和大小不用和国家参考品panel的相应疾病的微缺失微重复的区段完全一致？专家答复：一般情况下，需要和国家参考品保持一致。这个项目，还应充分考虑判断依据和临床是否常见的等综合因素，建议咨询相关老师。41咨询问题体外诊断定性试剂产品，临床存在了不同耐药类型，有一种药物耐药，也有两种和多种耐药类型，参考品需要包含所有临床耐药类型还是只包含耐药基因突变类型就可以？专家答复：一个基因位点发生不同的碱基突变，临床指征相同的耐药，参考品不能只选择1种突变型来代表，还是需要尽可能多的选择。42咨询问题对于罕见的型别可以使用细胞株（人类基因检测），怎么定义这个罕见？有可量化的指标来定义“罕见”吗？专家答复：要视项目具体情况而定。参考品的原材料应尽可能与临床样本相一致或接近，主要来源于临床样本，但也可来源于永生化细胞系、基因编辑细胞系，甚至也可来自基因工程构建产品、重组质粒等。本节主要针对检出限相关问题。43咨询问题LOB建立过程中，测试了60个数据，那这60个数据的数值中会有可能出现大于最后建立的LOB吗？专家答复完全有可能。空白样本单侧95%分布的上限为Lo