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文档简介

项目七常用疾病诊断技术任务六PCR扩增技术PCR是聚合酶链式反应的简称，是指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应。PCR反应具有强特异性、高灵敏度、快速简便等优点。PCR扩增原理（视频1）模板DNA的变性（视频2）变性温度与DNA中G-C含量有关（视频3）模板DNA与引物的退火（视频4）退火所需要的温度和时间取决于引物与靶序列的同源性程度及寡核苷酸的碱基组成。引物的延伸（视频5）延伸所需要的时间取决于模板DNA的长度。变性-退火-延伸每完成一个循环需2~4min，一次PCR经过30~40次循环，约2~3h。PCR反应的条件温度时间循环次数温度与时间的设置变性-退火-延伸变性90~95℃退火40~60℃延伸70~75℃变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。退火（复性）温度与时间（视频6）引物的长度碱基组成及其浓度靶基序列的长度对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。Tm值（解链温度）=4(G+C)＋2(A+T)复性温度=Tm值－(5~10℃)30~60sec延伸温度和时间选择在70~75℃之间，常用温度为72℃。（视频7）PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。3~4kb的靶序列需3~4min；扩增10kb需延伸至15min。循环次数30~40次PCR扩增产物分析严格的分析与鉴定凝胶电泳分析琼脂糖凝胶电泳：1~2%的琼脂糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶电泳：6~10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中。酶切分析分子杂交Southern印迹杂交斑点杂交核酸序列分析50uL反应体系PCR专用水41uLBuffer5uLP1、P2各1uLdNTP1uL（10mM）Taq酶0.5uL最后加入模板0.5uL。1.设置对照组，阴性对照必须有，阳性对照可选。2.可先配多管的体积，混匀再分装，并可多做一管的反应量，减少误差。PCR参数的设定99℃预热5min94℃变性30s55℃退火30s2

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