分子生物学实验课件：DNA体外重组技术

分子生物学实验

DNA体外重组技术概念

是在分子水平上，根据人们的需要以人工的方法取得感兴趣的目的基因，

在体外与载体DNA分子重组，然后将

重组分子转入受体细胞，并筛选出能表达重组DNA的活细胞，加以纯化、扩增，成为克隆。步骤

1.分离或合成感兴趣的目的基因---分2.构建、改造作为载体的DNA------切3.目的基因与载体DNA在体外重组--接4.重组DNA引入受体细胞----------转5.阳性重组子的筛选、鉴定、扩增-筛replicationtranslationtranscriptionreplicationtranscriptiontranslation一、目的基因的获得

1.从染色体DNA中直接分离2.人工合成3.由mRNA逆转录合成cDNA4.从基因组文库中筛选目的基因5.PCR获得

二、载体的选择

1.能在宿主细胞中独立复制，并能携带重组DNA

片段一同扩增；2.有合适的限制性酶切位点便于进行克隆；3.载体分子应尽量小，可插入较大的外源DNA而不影响复制；4.有一定的筛选标记，易于识别和筛选；5.表达型载体应配备与宿主细胞相适应的启动子、前导序列、增强子等调控元件；6.生物安全性好。

可将外源DNA携带进入宿主细胞的DNA称为载体。常用载体质粒病毒噬菌体三、酶切

限制性核酸内切酶（RestrictionEndonuclease，RE）：识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。BamHI四、连接

用DNA连接酶将目的基因与载体连接重组子。EcoRIEcoRI四、转化把以质粒为载体的重组DNA，在一定条件下引入受体细胞的过程称转化。以噬菌体或病毒构建的重组DNA引入受体细胞的过程称转染。接受了重组DNA的受体菌称为转化子或重组体。转化的方法感受态细胞及其特点注意事项五、筛选

在转化过程中,并非每个宿主细胞都被转化；

即使获得转化的细胞,也并非都含目的基因，可能含有自身成环的载体分子、一个载体与两个外源DNA形成的重组子、或插入的非目的基因与载体形成的重组子等。因此转化后须在不同层次,不同水平上进行筛选，以区别转化子与非转化子、重组子与非重组子，以及鉴定所需的特异性重组子。(一)根据重组子的遗传学特性筛选(平板筛选)1.插入失活

2.插入表达

3.营养素依赖表型

4.α-互补(蓝白斑筛选法)(二)限制酶图谱筛选(电泳筛选法)(三)核酸杂交筛选(四)免疫化学筛选筛选方法Pseudo-positivepositive

α互补的检测目录

X-gal

蓝色化合物

-半乳糖苷酶

Lac-Z基因蓝白斑筛选

分子生物学实验流程实验五：质粒提取，琼脂糖凝胶电泳实验六：质粒酶切，电泳鉴定，连接实验七；感受态制备，转化实验八：PCR鉴定，实验操作考试质粒概念：细菌染色体之外、能够独立复制、可赋予宿主细胞一定生物学性状的共价闭环双链DNA。特性:双链、闭合环状DNA，1-200kb；常含有编码某些酶的基因。分型：严紧型与松弛型。构型：超螺旋型SC---结构致密跑得快电泳时最快。开环型OC---体积最大,不易从胶孔中穿过。线型LC---居中。分离:将质粒与细菌的染色体DNA、RNA、蛋白等分离。

碱裂解法、煮沸法、去污剂法等。实验一质粒DNA的提取质粒的构型1.超螺旋DNA（supercoiledDNA,scDNA）超螺旋2.开环DNA(opencircleDNA,ocDNA)开环DNA3.线形DNA（linearcircleDNA，lcDNA)（四）与本实验有关的两种质粒1.PBR322(作为目的基因供体)

oriiamprtetr2.PUC18(作为载体）orii碱裂解法抽提质粒DNA的原理在pH高达12.6的条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但它的超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液去调其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型。而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。进一步用氯仿使蛋白质变性去除蛋白杂质，用无水乙醇沉淀质粒DNA，可得到纯化的质粒DNA。

【操作步骤】

挑取单菌落接种到含amp的LB液体培养基管内（3.5ml/管）↓放37℃振荡培养箱内培养过液将菌液倒入epp管中(尽量倒满)12000rpm/30秒(沉淀菌体)↓(可在原管中重复1次)

倒掉上清扣干,加入solutionⅠ100ul；（使菌体溶解）↓剧烈振荡打散菌体加入新配制的solutionⅡ200ul,温和颠倒3次，放室温5分钟↓加入solutionⅢ150ul,温和颠倒3次混匀放室温5分钟↓12000rpm/5分钟小心将含有质粒的DNA上清移至另一epp管中↓加等体积氯仿,轻微振荡，12000rpm离心3min，使蛋白质变性沉淀↓转移上清加入2倍体积冰冷无水乙醇,轻轻混匀室温放置5分钟↓12000rpm离心5分钟，使质粒DNA沉淀弃上清,加入70%乙醇洗涤沉淀质粒2次(液体尽量倒净并扣干).↓室温干燥10分钟，使乙醇蒸发加入1×TE40ul(溶解质粒),用0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定

注意:

沉淀溶于40μlTE待DNA完全溶解后，-20℃保存备用。取样品10μL做琼脂糖凝胶电泳鉴定。

【基本原理】DNA的电泳原理与蛋白质电泳基本相同。在pH高于其pI时，DNA分子带负电荷。在直流电场中DNA向正极泳动。不同的DNA分子因电荷数、构象和分子量大小的不同，在同一电泳系统中的泳动速度有差异，达到分离的目的。灌胶：胶中加入荧光染料(SYBRGreenI)加样：质粒+上样缓冲液混匀电泳结果观察：UV灯下

[操作步骤】1．凝胶板的制备取有机玻璃内槽，洗净、晾干。安装好，防止漏胶。将有机玻璃内槽置于一水平位置，放好样品槽模板（梳子），注意为防止胶漏，梳子不要插到底。

2．灌胶：将溶化的琼脂糖凝胶冷却至约65℃时小心地将凝胶倒入有机玻璃内槽上，控制灌胶速度，使缓慢地展开，直到整个有机玻璃板表面形成均匀的凝胶层，凝胶厚度一般为0.3～0.5cm。

3．室温下放置约1小时，待胶凝固完全后，将铺胶的有机玻璃内槽放在电泳槽中，加入0.5×TBE电泳缓冲液，液面高于凝胶面约0.5cm，轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的样品槽。4．加样：将样品和上样缓冲液5﹕1混匀，用微量加样器将样品分别加入胶板的样品小槽内，（注意：加样时应防止加样器头碰坏凝胶孔壁。实际样品加10μL，上样缓冲液加3μL）。

上样缓冲液含有的物质:指示剂（溴酚蓝和二甲苯青）：一般加在电泳上样缓冲液中，可使样品带色，便于上样、估计电泳时间和判断电泳位置。蔗糖：增加样品密度，使样品均匀沉到加样孔底部。

5．电泳：加样完毕后在靠近样品槽一端连接负极，另一端连接正极，接通电源，开始电泳，为防止样品扩散在样品进胶前可用略高电压，当样品进胶后，应控制电压不高于5V/cm(电压值V/电泳槽两极之间距离cm)。当染料条带移动到距离凝胶前沿1cm时，停止电泳。6．观测：将凝胶放在紫外灯观察台上，在波长254nm紫外灯下进行观察。在DNA存在的位置呈现出荧光,肉眼可观察到清晰的条带。

实验二质粒酶切、回收、限制性核酸内切酶实验用质粒的结构T4DNA连接酶限制性核酸内切酶(RE)来源：细菌和真菌作用：识别双链DNA分子中特异核苷酸序列并进行切割。分型：Ⅰ型

Ⅱ型---识别位点和切割位点一致，比较常用

Ⅲ型命名：酶来源的生物名称缩写

属名-种名-株名-发现次序根据其来源命名。如：属名菌株名

EcoRI

种名编号EcoRI来源于大肠杆菌E.coli的RY13菌株,I指在该菌株中分离的第一个限制酶。从流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae）菌株Rd分离的第三个限制酶HindШ

1．识别位点：一般长4～6bp，回文结构。

5’-CTGCAG-3’

5’-GTTAAC-3’3’-GACGTC-5’

3’-CAATTG-5’2．切割结果：平端切口，即在同一水平切割DNA双链；粘端切口，即两链的切口错开2～4个核苷酸。II型RE的特点ProductscleavedbyRE

COHESIVEENDSEcoRI5’…GAATTC…3’ 5’…G AATTC…3’ 3’…CTTAAG…5’ 3’…CTTAA G…5’

5’stickyendPstI 5’…CTGCAG…3’ 5’…CTGCAG…3’ 3’…GACGTC…5’ 3’…G ACGTC…5’

3’stickyend

BLUNTENDSHaeIII 5’…GGCC…3’ 5’…GG

CC…3’ 3’…CCGG…5’ 3’…CC

GG…5’酶切体系根据实验需要选择

DNA底物限制性内切酶

10X

Buffer：酶切缓冲液，H/M/LddH2O：补齐

酶量选择1.酶单位定义：37℃,1小时,在50μl体系中完全消化

1μgλDNA的酶量即1单位。

2.所需酶量：待酶切DNA上酶切位点数λDNA的MW

λDNA酶切位点数待酶切DNA的MW3.酶量选择：实际酶量为计算值的5-10倍。原因为：①酶部分失活;②纯度不高;③与被水解DNA的构型有关。

4.酶切缓冲液成分及作用：

①Tris-HCl，维持pH在7.4－8.0；②Mg2+，内切酶活性所必需；③NaCl/KCl，增加离子浓度，利于酶活性；④二硫苏糖醇(DTT)，保护酶，防止二硫键的形成。×酶切注意事项①根据实验目的选用内切酶;选择合适buffer

②-20℃冰箱中保存，使用时应置于冰中。③吸头不能反复使用。④酶切底物DNA要纯，加完酶后要在离心机上“甩”一下。⑤所加酶体积不应超过总酶切体系的1/10,甘油影响。⑥底物DNA纯度会影响酶切结果。⑦置于最适作用温度下酶切。⑧酶切反应时最后加酶⑨尽量减少操作时间。⑩酶解温度及时间的控制实验用质粒的结构pBR322---作为目的基因供体经HindⅢ及PstI切割后得779bp及3.6kb两片段，其中779bp做为本实验的目的基因。pUC18---作为载体

pUC18经Pst和HindⅢ酶切割后，得18bp和2.67kb两片段，2.67kb作为本实验的载体。

1.用HindⅢ酶切：提取的质粒(pUC18或pBR322)30μL↓加入10×RBuffer4μL,双蒸水4μL,加HindⅢ2μL(12U/μL)↓（终体积为40μL)37℃水浴2h。实验步骤2．用PstⅠ酶切：向上述酶切体系中加入1/10体积(4μL)的3mol/LNaAC溶液混匀↓加入2倍体积的无水乙醇,室温放置5min↓离心12000rpm/5min去上清,向沉淀(DNA)中加入70%乙醇洗涤↓12000rpm，2min，倒净液体,扣干，室温放置15～30min，自然干燥↓加10μL1×TE溶液溶解DNA加入10×Obuffer2μL,双蒸水6μL，PstⅠ2μL(12U/μL)↓(终体积为20μL)37℃水浴2h，用电泳检查酶切结果M酶切结果的鉴定--琼脂糖凝胶电泳实验操作流程HindIII酶切pUC18↓回收目的片断↓PstI酶切pUC18↓电泳鉴定、切胶回收目的片段2.6kb将目的片断与pUC18于16℃连接过夜HindIII酶切pBR322↓回收目的片断↓PstI酶切pBR322↓电泳鉴定、切胶回收目的片段779bp实验三连接、感受态的制备、重组子转化E.coli及阳性重组体筛选连接感受态的制备转化筛选T4DNA连接酶1.来源T4噬菌体感染的大肠杆菌；2.最佳pH值7.2～7.8,常用的反应液为pH7.6的Tris-HCl缓冲液；3.需ATP,Mg2+参加反应；4.二硫苏糖醇等巯基化合物可促进连接酶的连接作用；5.高浓度的Na+,K+等抑制酶的活性。连接体系

目的DNA：9ul

载体DNA:3ulT4DNA连接酶:1.5ul

10ⅹligationbuffer:1.5ulddH2O:0ul终体积15ul16℃过夜连接感受态细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。CaCl2法是目前实验室常用的制备感受态细胞的方法，其原理是使细菌处于0℃、CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，细胞膜的通透性发生改变，外源DNA附着于细胞膜表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物。本实验以JM109菌珠为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于感受态。感受态细胞的制备（1）从新活化的JM109菌平板上挑取单菌落，接种于5mlLB液体培养基中（不含Amp），37℃振荡培养12h左右，至对数生长期，将该菌液以1:100～1:50转接于100mlLB培养基中，37℃振荡培养2～3h（OD600约0.2～0.4）。√（2）将菌液冰浴10min后，转入离心管中，于4℃离心4000rpm，10min，去上清，收集菌体。（3）用10ml冰预冷的0.1mol/LCaCl2悬浮细胞，冰浴15～30min。（4）0～4℃，离心4000rpm，10min。（5）弃上清液，每50ml初始培养物加入2ml冰预冷的0.1mol/LCaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置30min。（6）制备好的感受态细胞悬浮液可在冰上放置24h内直接用于转化实验，也可加入1/10高压灭菌甘油,置-70℃冻存。转化转化：把以质粒为载体的重组DNA，在一定条件下引入受体细胞的过程。转染：以噬菌体或病毒构建的重组DNA引入受体细胞的过程称。接受了重组DNA的受体菌称为转化子或重