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文档简介

时间分辨荧光免疫分析仪陈海蔚中南大学湘雅三医院主要内容时间分辨荧光技术基础理论时间分辨荧光分析仪测定项目的临床应用9999933333问题★荧光的基本知识★什么是时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)?★TRFIA的标记物及特点★为什么叫“时间分辨”?★TRFIA的检测原理★各种免疫方法学的比较★TRFIA的临床应用一、荧光的基本知识荧光(fluorescence)

荧光物质吸收激发光的能量后,电子从基态跃迁到激发态,当其回复至基态时,以发射光形式释放出能量,称为荧光。

荧光的基本知识发射光谱和激发光谱发射光谱是指固定激发光波长,在不同波长下记录到的样品发射荧光的强度。激发光谱是指固定检测发射光波长,用不同波长的激发光激发样品所记录到的相应的荧光发射强度。荧光的基本知识荧光效率定义:荧光物质分子将光能转变成荧光的百分率计算公式:

荧光效率=

荧光的基本知识荧光寿命定义:荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程度时所用的时间。各种荧光物质的荧光寿命不同。荧光的基本知识荧光淬灭定义:荧光物质在某些理化因素作用下,发射荧光减弱甚至消退称为荧光淬灭。如紫外线照射、高温、苯胺、酚、硝基苯、I-等。荧光偏振

FH-FLP=──────

FH+FL荧光的基本知识P表示偏振度二、荧光物质荧光物质是一类能吸收激发光的光能而发射荧光的物质。常用的荧光物质荧光物质最大吸收光谱最大发射光谱应用异硫氰酸荧光素(FITC)490~495nm520~530nm(黄绿色)FAT、荧光偏振免疫测定四乙基罗丹明(RB200)570~575nm595~600nm(橙红色)FITC的衬比染色或双标记FAT四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)550nm620nm(橙红色)FITC的衬比染色或双标记FAT藻红蛋白(PE)490-560nm595nm(红色)双标记FAT、流式细胞术7-氨基-4-甲基香豆素354nm430nm(蓝色)双标记或多标记FATEu3+螯合物340nm613nm时间分辨荧光免疫测定三

荧光免疫分析的类型荧光免疫分析的基本原理将抗原抗体反应与荧光物质发光分析相结合,用荧光检测仪检测抗原抗体复合物中特异性荧光强度,对液体标本中微量或超微量物质进行定量测定。荧光抗体技术荧光免疫测定均相荧光免疫测定(homogeneousfluorescenceimmunoassay)

非均相荧光免疫测定(heterogeneousfluorescenceimmunoassay)荧光免疫技术荧光免疫技术是将抗原抗体反应的特异性与荧光技术的敏感性相结合,对抗原或抗体进行定性、定位或定量检测。荧光免疫技术的类型荧光免疫测定同酶免疫测定一样,根据抗原抗体反应后是否需要分离结合的/游离的荧光标记物而分为均相和非均相两种类型。基本反应式如下:Ab*+Ag→Ab*Ag+Ab*(Ab*Ag代表结合的标记物,Ab*为游离的标记物)。在抗原抗体反应后,先把Ab*Ag与Ab*分离,然后测定Ab*Ag或Ab*中的标记物的量,从而推算出标本中的Ag量,该方法称为非均相荧光免疫测定法,如时间分辨荧光免疫测定(time-resolvedfluorescenceimmunoassay,TRFIA)荧光免疫测定的方法类型

非均相荧光免疫测定:

时间分辨荧光免疫测定均相荧光免疫测定:

荧光偏振免疫测定、荧光酶免疫测定四、时间分辨荧光免疫(TRFIA)

(Time-ResoledFluoroimmunoassay)定义TRFIA分析法是用三价稀土离子及其螯合剂作为示踪物,代替荧光物质、同位素或酶,标记蛋白质、多肽、激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞,当反应体系发生后,用TRF仪器测定最后产物中荧光强度。根据荧光强度或相对荧光强度比值,来判断反应体系被分析物的浓度,达到定量分析之目的。发展历程1979年,芬兰SOINI和HEMMIA

提出“时间分辨荧光免疫分析”理论1983年SOINI和KOJOLA

提出以镧系元素标记为示踪螯合物和时间分辨荧光测量相结合,建立一种新的非放射性微量分析技术现已经成为生物医学研究和临床超微量生化检验中一项最有发展前景的分析手段。标记物为具有独特荧光特性的稀土金属---镧系元素镧系元素共有15种,属三价元素,应用在时间分辨荧光免疫技术中有四种:铕(Eu)、钐Sm)、镝(Dy)、铽(Te)Eu3+的应用最为广泛,

Sm3+可作为第二种选择以进行双标记或多标记技术不同的三价稀土离子具有不同发射光谱和各自不同的荧光寿命等特点,这样就适合进行双标记和多标记,从而实现可同时检测一个样品中,两种或两种以上的抗原或抗体,即一个试剂盒相当与两个试剂盒或多个试剂盒,这就是我们所说的多标记技术。

五、镧系元素荧光特点荧光寿命极长镧系元素螯合物(60~900us)<铕:714us>普通荧光免疫中荧光团:1~100ns样本中蛋白质荧光:1~10ns,易猝灭。Stokes位移大铕:发射光613nm±10nm、激发光300~350nm,荧光素的Stokes位移近280nm荧光特异性强。(发射光谱带很窄:615±5nm)解离-增强技术可使其荧光性提高100万倍

镧系元素铕(Eu3+)(最常用)钐(Sm3+)铽(Tb3+)钕(Nd3+)镝(Dy3+)标记物荧光物质荧光寿命(ns)荧光物质荧光寿命(ns)非特异荧光背景1~10Sm3+-β-NTA65000人血清蛋白4.1Sm3+-PTA60000球蛋白3.0Eu3+-β-NTA714000细胞色素C3.5Eu3+-PTA925000FITC4.5Tb3+-PTA96000丹黄酰氯14Dy3+-PTA1000罗丹明B3.0常见荧光物质的荧光寿命Stokes位移Stokes位移:是指激发光谱与发射光谱之间的光谱波峰的波长差。例如TRF中铕的激发光波长340nm,发射光波长613nm,两者之间的波长差即Stokes位移为273nm(见图2),所以激发光和发射光很容易用干涉滤光片分开。而普通荧光物质的激发光与发射光之间的波长差即Stokes位移为28nm,那就很难排除激发光对发射光的干扰,影响检测结果。稀土离子激发光、发射光和Stokes位移

稀土离子螯合物激发光波长(nm)发射光波长(nm)Stokes位移(nm)Eu-螯合物

340613273Sm-螯合物

340600260Tb(铽te)-螯合物

295490/543195/248Dy(镝di)-螯合物

295573278利用镧系元素光谱特点,将发射荧光与激发荧光分辨开来,零本底的又一保障发射光谱与激发光谱间存在的巨大Stokes位移。可以通过干涉滤光片将发射光谱与激发光谱完全分离。图2解离增强技术解离增强技术是TRF技术中所特有的。指当免疫反应完成后部分标记物结合到固相载体上,未结合的标记物被洗掉。再加入低PH值(PH2~3)的增强液,把Eu或Sm从免疫复合物中解离下来,与增强液中的螯合物质(β-二酮体)结合形成新的螯合物,使标记物产生的荧光强度增强近百万倍。

六、时间分辨生物制品(如蛋白质)本身产生的荧光波长位于400-600nm,所以用普通荧光素来检测生物样品时,自然本底的荧光干扰太大。样品中蛋白质类的本底荧光衰变时间约为1-10nsTRFIA技术中,由于镧系稀土离子螯合物所产生的荧光不仅强度高,而且半寿期也长,介于10-1000us之间,比普通荧光标记物高5-6个数量级(1000ns=1us)。含有铕或钐的螯合物的荧光衰变时间分别为730000ns和50000ns。因此利用延缓测量时间,待测样品中短寿命的自然荧光完全衰变后,再检测稀土离子螯合物的荧光信号(见图1)。消除了来自样品、试剂及其他非特异荧光,从而达到降低自然本底荧光和消除样品荧光的干扰,大大提高了检测灵敏读。这即是我们长提到的时间分辨。通过时间延迟,将特异性荧光与非特异性荧光分辨开来,使本底达到0利用镧系元素荧光物理特性,荧光激发后在固定时间段检测特异性荧光。而在此时间之前,非特异性荧光已完全衰减为0图1比活性:单位时间每个标记分子被探测的信号量荧光激发光源1000次/S激发,比活性提高荧光标记物的相对比活性七、时间分辨荧光免疫的检测原理用三价稀土离子及其螯合物作为示踪物,代替荧光物质、同位素、酶和化学发光物质,标记抗原、抗体、核酸探针等物质;当免疫过程结束后,根据稀土离子螯合物的荧光光谱的物理特点(Ⅰ特异性强、ⅡStokes位移大、Ⅲ寿命长),并采用解离-增强技术(ⅣDELFIA)放大有效荧光;最后用时间分辨荧光分析仪,测定免疫反应最后产物的荧光强度。根据已知浓度所确定的标准曲线,来判断未知样品的浓度值,以达到定量分析的目的。利用镧系元素荧光物理特性,荧光激发后在固定时间段检测特异性荧光而在此时间之前,非特异性荧光已完全衰减为0时间分辨荧光免疫原理图信号检测TRFIA采用的激发光源为脉冲氙灯,其工作频率约为1000次/秒,由光导纤维、光二极管、积分器P1和闪光管触发器组成脉冲光源控制系统。1秒钟内脉冲光源发射激发光(340nm)1000次,1次循环为1ms,其中3us用于发射脉冲激发光,再延迟397us让非特异性本底荧光衰退后,记录401~800us内Eu3+发出的荧光(613nm),再停留200us,待荧光基本熄灭后再进行下一个循环。标记方法

双功能螯合剂:1-(对-苯偶氮)-EDTA异硫氰酸苯基-EDTA异硫氰酸苯甲基-DTTA二乙烯三胺五乙酸(DTPA)标记方法:一步法:先螯合Eu3+,再连接蛋白质二步法:先连接蛋白质,再螯合Eu3+方法类型

双抗体夹心法固相抗体竞争法固相抗原竞争法方法类型时间分辨荧光免疫测定(双抗体夹心法)示意图双抗体夹心法固相抗体和Eu3+标记抗体与待检抗原结合,形成固相抗体-待检抗原-Eu3+标记抗体复合物,酸性增强液下,Eu3+解离,340nm激发光下发射613nm荧光。方法类型固相抗体竞争法待检抗原和Eu3+标记抗原与固相抗体竞争结合,温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光强度,荧光强度与待检抗原含量成反比。方法类型固相抗原竞争法待检抗原和固相抗原竞争结合定量的Eu3+标记抗体,温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光强度,荧光强度与待检抗原含量成反比。灵敏度高:最小检出量10-18mol/L分析范围宽:4~5个数量级标记物稳定:有效使用期长测量快速,易自动化易受污染,本底增高方法评价微量反应孔包被好的表面抗体表面抗原V标记物轻链螯合剂Eu重链VVHHHHHHHHHHHHHHH时间分辨荧光免疫原理图

(Time-resolvedFluorescenceImmunoassay)DELFIA技术为临床检测带来的先进性技术特点检验先进性时间分辨光谱分辨特异性荧光与非特异性荧光分离发射荧光与激发荧光分离零背景、高特异性解离-增强荧光性大大提高稳定的荧光螯合物线性范围更宽重复性更好原子标记

标记位点多,可达20个对标记物结构及活性影响小无衰变受环境影响小高稳定性,高精确度试剂保质期至少一年标准曲线保留时间长同一批次只需两点定标多标记单,双,三,四标记同一试剂盒可同时测多个项目灵敏度更高,检测范围更广以下数据均出自于各制造厂家自己的产品说明书试剂 DELFIA ImmuliteACS-180 AFP 0.1-1000IU/ml 0.2-300IU/ml 1.0-1000IU/ml CEA 0.1-500ng/ml 0.2-500ng/ml 0.5-100ng/ml HCG 0.5-10000U/L 5-5000U/L 2-1000U/L

TSH 0.005-100μU/ml 0.002-75μU/ml 0.03-150μU/mlFSH 0.05-256mU/ml 0.1-170mU/ml 0.3-200mU/ml Prog 0.08-120nmol/L 无 0.1-40ng/ml

Prolactin 0.04-250ng/ml 0.5-150ng/ml 0.3-200ng/ml

时间分辨荧光免疫检测的标准曲线相当稳定,同一批次的试剂盒可用两点法加批次的参考曲线定标0.5125102050100200500 U/L51002000Cps.103DELFIAhFSHN=6标准曲线稳定,试剂保质期时间长重复性好同一标本连续20次检测,CV值∠2%。同一批(10个)标本连续3天检测,其CV值=2.9%检测后反应板连续3天重复阅读,CV值∠1%八、现有时间分辨荧光分析仪测定

项目介绍现有时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍传染科检查

乙肝系列:HBsAg表面抗原

HBsAb表面抗体

HBeAge抗原

HBeAbe抗体

HBcAb核心抗体开发中:HBcAg(核心抗原)、抗-HBc-IgM

现有时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍内分泌科检查

1甲状腺功能系列:T3三碘甲状原氨酸T4甲状腺素FT3游离三碘甲状原氨酸FT4游离甲状腺素TSH-U促甲状腺素超敏感TBGAb甲状腺结合球蛋白TPOAb甲状腺过氧化物酶现有时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍2糖尿病系列:InS胰岛素

C-PC-肽3生长激素:hGH生长激素现有时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍妇产科检查

hCG绒毛膜促性腺激素

LH-Spec黄体生成素特异性

FSH促卵泡激素

PRL催乳素

E2雌二醇

Testo睾酮

Prog孕酮

SHBG性激素结合球蛋白现有时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍肿瘤科检查

AFP甲胎蛋白

PSA前列腺特异抗原

B2-MBeta2微球蛋白

NSE神经元烯醇化酶

PAP前列腺酸性磷酸酶

CEA癌胚抗原

PSAFree/total前列腺特异抗原/总量现有时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍遗传科检查1产前筛查:

hAFP/FreeβhCG甲胎蛋白/游离绒毛膜促性腺激素

PAPP-A妊娠相关血浆蛋白

μE3游离雌三醇2新生儿筛查

NeoneotalhTSH新生儿筛查促甲状腺素

NeoneotalT4新生儿筛查甲状腺素

NeoneotalPKU新生儿筛查苯丙酮尿症

Neoneotal17α-OH-Prog17-α-羟基酮现有时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍血液科检查1贫血检查

Ferritin铁蛋白

VitB12维生素B12folate叶酸2白血病分型、免疫细胞分型、细胞毒试验等。其它科研九、时间分辨荧光免疫分析与其它

免疫学方法的比较标记免疫学发展历程酶联免疫 (精度:10-9mol/L)放射免疫 (精度:10-12mol/L)化学发光(精度:10-15mol/L)电化学发光 (精度:10-17mol/L)时间分辨荧光(精度:10-18mol/L)生物芯片(未知)

酶免疫技术荧光抗体技术三大标记技术放射免疫分析

待测物质浓度与检测手段

临床化学分析pg/mLng/mLmg/mLmg/mLg/L免疫分析TherapeuticDrugs(药物浓度)ThyroidHormone(甲状腺激素)FertilityHormone(孕激素)CancerMarkers(肿瘤标记物)InfectiousDisease(传染病)Vitamins(维生素)SerumProteins(血清蛋白)10-1210-910-610-310-0各种免疫方法学的比较放射性免疫分析法(RIA)

---标记物:125I应用放免自60年代问世以来对临床诊断起了革命性的贡献,是一项较为成熟的诊断技术。夹心法、竞争法的标记原理为以后的检测技术的发展奠定了基础。缺点放射性(125I),对环境的污染及对身体的危害,已经为重视环保的国家逐步取消。(如整个欧洲仅尚存几个放免试验室)125I的半衰期短而导致其试剂有效期短。标记物125I的稳定性差,导致试剂盒批间、批内的变异较大;标准曲线有效期短,必须每次定标,造成浪费。操作繁琐,出报告时间长。无法保存备用。酶免疫分析法(ELISA)

---标记物:HRP(辣根过氧化物酶)应用酶免的最大优势在于避免了对环境和人体危害。试剂有效期较长。衍生技术:荧光酶免疫分析增强化学发光酶免疫技术磁酶免分析曾经一度被认为是取代放免的检测手段。缺点灵敏度、重复性不及放免,易造成漏检和假阳性。因酶的纯度和反应过程容易受环境因素影响,导致稳定性不好。化学发光免疫分析法(CLIA)

---标记物:化学发光物质(鲁米诺)应用单个样本检测速度快,适合做急诊。灵敏度较高。自动化程度高。仪器种类:拜耳—ACS180系列雅培—AXSYM贝克曼—ACCESS德普—IMMULITE缺点样品不能重复检测;出现故障则整批试剂及血样报废。本底较高,易受环境物质干扰。仪器故障率较高。标准曲线稳定性较差,需多次定标。检测精度不高,在超微量分析及早期诊断方面能力不足。非开放性试剂;试剂价格高。电化学发光免疫分析(ECL)

---标记物:三联吡啶钌应用80年代末期问世的新型化学发光免疫分析方法。基本原理:根据三联吡啶钌[Ru(bpy)3]和三丙胺在电场触发下产生发光的化学发光反应。本底较小、灵敏度较高、线性范围较宽。缺点仪器检测速度慢(罗氏公司)ECL1010——60测试/小时ECL2010——90测试/小时非开放性试剂系统、不能做科研。试剂价格过高。用TRF的理由先进的方法学操作简单试剂有效期长标准曲线稳定重复性好当天可出报告可测项目多(58+24)对操作人员没有伤害-----------乙肝“两对半”TRFIA定量检测原理示意图十、TRFIA的临床应用乙肝表面抗原免疫反应图

(时间分辨荧光法)乙肝表面抗体免疫反应图

(时间分辨荧光法)乙肝e抗原免疫反应图

(时间分辨荧光法)乙肝e抗体免疫反应图

(时间分辨荧光法)乙肝核心抗体免疫反应图

(时间分辨荧光法)TRFIA在乙肝“两对半”定量检测应用(一)提高了检测的灵敏度

时间分辨荧光法(TRFIA)检测HBsAg灵敏度可达到0.2ng/ml,而酶免法(ELISA)检测HBsAg灵敏度是1ng/ml。

缩短了急性乙肝检测的“窗口期”(二)动态观察疗效和病情检测

疾病的发生、发展、疗效、预后是个动态的变化过程,TRFIA定量检测乙肝“两对半”各项标志物的浓度变化可对乙肝的病程、治疗、预后起到动态检测的作用,指导医生治疗。(1)定量分析HBsAg和HBsAb浓度的变化,可以预见急性乙肝是否处于恢复期

如HBsAg浓度降低,HBsAb逐渐升高,说明病情正向恢复期发展。反之,HBsAg浓度处于高水平或上升,而HBsAb处于低水平,则容易发展为慢性乙肝或携带者。(2)定量分析HBeAg和HBeAb的浓度变化,可以反映病情变化和治疗效果。

1、HBeAg向HBeAb转换时期,即表现为HBeAg浓度下降和HBeAb浓度升高。

2、高浓度的HBeAg提示病毒处于高复制状态,有较强传染性。

3、高浓度的HBeAb一方面提示病情的好转,但在有些时候(如肝功能指标很差)可能与肝坏死、肝硬化、肝癌有关。(3)HBcAb浓度的高低可以反映病毒感染的状态

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