Percoll 分离细胞的学习资料

Percoll分离细胞的学习资料第1页/共15页密度梯度离心用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，中间或底层，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。离心力，离心时间和离子转子因介质和被分离物而已。介质(media)的要求：

1.能产生密度梯度

2.密度高时，粘度不高

3.pH中性或易调为中性

4.浓度大时渗透压不大

5.对细胞无毒第2页/共15页梯度离心常用介质蔗糖(Sucrose)

主要的不足表现为：

1.高渗透压，密度越高渗透压越大，易使被分离物在所在的梯度带因渗透压不适，而导致被分离物损伤。

2.分子量过小(342)易使蔗糖渗入到细胞膜进入到细胞质，从而破坏细胞。

3.高粘性盐(Salts)

常用的有CsCl,K-tartrate和NaBr,主要不足同蔗糖1，2。多聚蔗糖(Polysucrose)

即所谓的Ficoll,分子量为400000左右，其主要特点为弥补了蔗糖的高渗透压，但也是密度越高，渗透压越大。最大的弊端是太过粘稠，为蔗糖的好几倍，不易脱糖。

第3页/共15页碘化物(Iodinatedcompounds)

常用的有：Hypaque(泛影钠)，Urografin(泛影葡胺),Metrizoate(甲泛影钠)等。混合介质(Mixedmedia)

常用的有：Ficoll-Paque,Histopaque,Histoprep,Lymphoprep等。硅胶(Colloidalsilica)

即所谓的percoll，“Ofallsubstancestested,nonecameclosertoprovidingallthedesiredcharacteristicsthancolloidalsilica.”

第4页/共15页Percoll理化特性平均分子量6×106,渗透压<20mOsm，密度1.13g/ml.pH中性，生理盐水配制的percoll应用液等渗.平均直径10-30nm.硅胶经处理后，对细胞无毒性.（注：硅溶胶对细胞有毒性）

主要是在SiO2coated一层聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)

A:0.15MNaCl,35nmB:0.25MSucrose,30nm第5页/共15页Percoll的使用市售原液

1.100%percoll原液使用时percoll原液:10×生理盐水=9:1配制成percoll应用液，再用生理盐水将percoll应用液调制成各个梯度。

2.已经用10×生理盐水配制好的percoll应用液使用时只需用生理盐水将percoll应用液调制成各个梯度即可。梯度设置

1.Stepgradients(不连续梯度)第6页/共15页2.Continuousgradient(连续梯度)(1)高速离心

(2)梯度混合器第7页/共15页样品的放置

1.与percoll液混匀

2.置于梯度顶层

3.置于梯度底层

需用较大的离心力样品的收集第8页/共15页Percoll在贝类血细胞分选上的应用SeparationofEuropeanflatoyster,Ostreaedulis,haemocytesbydensitygradientcentrifugationandSDScharacterisationofseparatedhaemocytesub-populations

——QingGangXue,RenaultTristanFish&ShellfishImmunology(2000)10,155–165第9页/共15页血细胞样品处理上Percoll梯度：10%，30%，50%和70%

结果：10/30%界面处形成一带(P1)，50/70%界面处也形成一带(G)。上Ficoll梯度：5%，10%，15%和20%

结果：5/10%界面处形成一带(F1)，10/15%界面处也形成一带(F2)。血细胞染色SDS第10页/共15页P1G第11页