CER4-合成的关键酶

精品文档CER4编码拟南芥蜡质合成中醇 -脂酰CoA还原酶的过程蜡状表皮主要发挥保护性屏障作用，帮助植物地上部分抵御非控制性的水分丢失和环境破坏。其由角质层聚合物机体和腊合成。表皮蜡质是由长链脂肪酸和其衍生物组成的复合混合物。我们研究了拟南芥(Arabidopsisthaliana)蜡质生物合成基因CER4的分子克隆和特征。拟南芥突变株茎秆中的伯醇和腊酯表达水平显示出下降的趋势，而醛类、烷烃类、仲醇和酮类表达水平显示出轻微的上升。这种表现方式表明CER4编码醇-脂酰CoA还原酶（FAR）。我们在拟南芥中鉴定出8个与荷荷芭jojoba(Simmondsiachinensis)种子醇-FAR表达高度相关的FAR类基因。CER4等位基因和互补基因组的分子特征表明这8个基因之一，At4g33790，编码蜡质合成的FAR。酵母(Saccharomycescerevisiae)中CER4cDNA表达结果为C24：0和C26:0伯醇的积累。全功能绿色荧光蛋白标记的CER4蛋白通过显微镜被定为在酵母细胞的内质网中。通过反转录PCR进行基因表达分析表明CER4启动子在叶片、茎秆、花朵、长角和根中表达。我们探测到在转基因植物叶片和茎秆的表皮细胞中CER4驱动β-葡糖醛酸酶报告基因的表达，这与表皮蜡质生物合成中CER4探测到的作用是一致的。在幼根的延长区域所有细胞中CER4是表达的。这些数据表明CER4是一个醇FAR，其对长链脂肪酸具有特异性，也负责地上和根部表皮细胞伯醇的合成。连续的亲脂层叫做角质层，其覆盖维管植物大量的裸露表层。角质层是由表皮细胞合成的，表皮细胞是它们的特征之一。角质层的主要功能是作为防水障碍。其束缚着非正常的水分流失和阻止雨水，从而降低了灰尘，花粉和孢子的沉积(Kerstiens,1996;RiedererandSchreiber,2001)。角质层能够保护潜在的组织防止UV紫外线过量的辐射、机械损害、细菌、致病菌的侵染(Jenksetal.,2002)以及昆虫的迫害(EigenbrodeandEspelie,1995)。而且，角质层在植物的生长过程中通过阻止临近器官细胞壁融合而发挥关键作用(Sieberetal.,2000)。角质层主要由角质素和腊类组成。角质素是角质层的主要成分，由C16和C18羟基组成，环氧脂肪酸单体(Heredia,2003)以三维矩阵的方式覆盖于上皮细胞壁。表皮蜡质被包埋在角质素矩阵内，覆盖于真角质层（上表皮）。表皮蜡质通常以晶体的形式存在，并以足够浓度的结晶花传输到植物体的表面。表皮蜡质是一个脂肪复合混合物，主要由长链脂肪族分子组成，包括伯，仲醇，醛类，烷烃类和酯类，这些主要来自于饱和长链脂肪酸的派生(VLCFAs)。每种脂质类都以一系列长链特征出现(e.g.C24,C26,C28,C30)或以一个长链占主要成分。不同物种之间蜡质的承载量和组分是具有不同变化的(Post-Beittenmiller,1996)。甚至在一个物种上，不同器官和组织的蜡质成分也是变化的，但生长期间除外。在生殖生长过程中蜡质的沉积或许受环境信号的变化而影响，如光照，湿度和温度等(Kolattukudy,1996)。蜡质生物合成的第一个阶段为发生在质体中饱和的C16和C18脂酰CoA的延长，产生长度为20和34之间碳原子VLCFA腊前体。通过内质网(ER)的多酶系统-脂肪酸延长酶来催化脂肪酸的延长(vonWettstein-Knowles,1982)。长链脂酰CoA被合成后，它们将通过脱羰基途径转化为醛类中间体和奇数烷烃类，仲醇和酮类(CheesbroughandKolattukudy,1984;Schneider-BelhaddadandKolattukudy,2000)，或者通过脂酰还原途径转化为伯醇和腊酯类(KunstandSamuels,2003).。尽管主要的蜡质生物合成步骤已经被确定下来，但是我们对于酶类的参与以及它们催化生物化学反应的机理的了解是有限的。仅有小部分已知功能编码生物合成酶类基因从拟南芥。1欢迎下载精品文档(Arabidopsisthaliana)和玉米(Zeamays)中被克隆出来。例如：CER6,KCS1,GL8A,GL8B,和CER10是脂肪酸延长酶的组分，是产生VLCFA腊前体所必须的(Xuetal.,1997;Millaretal.,1999;Toddetal.,1999;Fiebigetal.,2000;Dietrichetal.,2005;Zhengetal.,2005)。CER1,GL1,和WAX2是都包含3个富His特征的一系列完整细胞膜酶类(Aartsetal.,1995;Hansenetal.,1997;Chenetal.,2003;Kurataetal.,2003;Sturaroetal.,2005)。尽管其新陈代谢作用已经被阐述，但是目前还不能掌握相关蛋白的生物化学反应。其它的基因可能编码蜡质产生中的调控蛋白CER2,GL2,CER3,GL15,和WIN1/SHN1(Tackeetal.,1995;Hannoufaetal.,1996;MooseandSisco,1996;Negruketal.,1996;Xiaetal.,1996;Aharonietal.,2004;Brounetal.,2004) ，但是它们的调控功能仍旧需要被证实。最终， CER5编码一个定位在质膜上的ATP绑定转运子，其是腊转运到角质层所必须要求的 (PighinandZhengetal.,2004) 。显而易见，在蜡质相关基因克隆过程中， 没有特异性的酶类催化脂肪酸延长一系列反应。 所以，当前关于酰基还原途径描述的大部分信息来自于早期对于植物角质层腊的形成阐述， 以及来自于近期参与器官和组织中VLCFA伯醇和烷烃，酯类相关基因特征研究中。蜡形成的生物化学机理首先在甘蓝中被检测（Brassicaoleracea），获得的假说为这个过程包括两个阶段，分别由两个独立的酶类所催化的，一个是 NADH依赖型脂酰还原酶（ FAR），其降低脂酰CoA形成自由的醛类，另一个为NADPH依赖型醛基还原酶，其将醛类转化为伯醇 (Kolattukudy,1971)。随后在荷荷芭(Simmondsiachinensis)胚胎(Pollardetal.,1979)和豌豆(Pisumsativum)的叶片(VioqueandKolattukudy,1997)中进行了生物化学研究，荷荷芭特异性醇－形成FAR基因在异源的蚕类昆虫，小鼠和人类细胞中功能表达(Metzetal.,2000)，说明了VLCFAｓ的醇生物合成是通过一个单一醇－形成FAR所催化的无醛类中间体释放过程。拟南芥中相应的FARｓ参与蜡质生物合成还没有被研究，也不了解是否在酰基还原途径中从脂酰CoA前体到伯醇这个过程有一个或者两个酶催化。早期的研究(Hannoufaetal.,1993;McNevinetal.,1993;Jenksetal.,1995)已经确立Arabidopsiscer4突变株茎秆几乎完全缺乏伯醇(andwaxesters)，说明了CER４参与脂酰还原途径(Jenksetal.,1995)。将光滑的表面的茎秆与野生型拟南芥绿色茎秆表面进行比较，通过目视法筛选突变株已经分别鉴定出cer4等位基因。在Ler生态型(Koornneefetal.,1989)中Cer4-1是一个快中子诱发突变株，在Ws生态型(McNevinetal.,1993)中cer4-2是一个T-DNA诱导突变株。这项工作的目标就是克隆和描述混乱在拟南芥cer4突变株中的基因，研究是否CER4蛋白（1）的确是FAR；（2）能够形成醛类和伯醇；（3）具有长链特异性酯酰底物；（4）负责植株所有器官中蜡质醇的形成；（5）确定它的亚细胞定位。结果CER4基因的分子鉴定将假定的荷荷芭FAR氨基酸序列利用BLAST检索拟南芥基因组数据库，结果显示在拟南芥基因组中有8个序列与荷荷芭FAR整个长度是高度相关的（28%-54%氨基酸序列）（图1）。序列之一MS2（At3g11980），这个基因编码花粉受精所必需的膜特异性蛋白(Aartsetal.,1997)，但是拟南芥中其它7个FAR类基因没有被研究过。为了确定是否这些基因相对应的CER4参与角质层伯醇的形成，我们利用拟南芥图谱对比cer4突变体与鉴定的FAR类序列。假定的FARs之一，At4g3390，在4号染色体60.9cm与CER4基因图谱匹配(Koornneefetal.,1989)，考虑到这可能是CER4的候选体。At4g33790基因克隆序列与全长cDNA序列(GenBankaccessionnos.AY057657andAY070065;Yamadaetal.,2003)比较显示出一个错误的基因组序列(GenBankaccessionno.NC_003075)。这个错误是一个附加的核苷酸造成预测的编码序列阅读框的移动。正确的At4g33790基因由10个外显子组成 (Fig. 2A)，整个外显子-内含子区域共有 3567bp。全长cDNA。2欢迎下载精品文档序列包含一个1482bp开放阅读框，编码一个 493氨基酸蛋白质。 Cer4-1突变体中At4g33790基因的PCR扩增结果表明一个缺失部分或者至少 3350bp含有500bp启动子区域将重新排列， 5’端未翻译区域，翻译起始下游至少有 2800bp。突变株cer4-2中一个T-DNA插入序列出现在At4g33790(atnucleotide1,960relativetothestartcodon) 的第4个内含子上。两个带有相同光滑茎秆蜡质表现型突变株系的独立分离相同基因上都发生变化的结果表明确定At4g33790编码CER4。为了证实CER4基因的存在，从拟南芥生物资源中心 （ABRC）的At4g33790中我们获得了2个SALKT-DNA插入株系，SALK-038693（cer4-3）和SALK-000575（cer4-4），分别包含第五个(nucleotide2,225)和第四个(nucleotide1,755)外显子嵌入的T-DNA。Cer4-1和cer4-2纯合体表现出光滑茎秆表现型与前期描述的cer4-1和cer4-2株系相似。最终，cer4基因敲出的范围通过半定量反转录（RT）-PCR来检测。在cer4-2，cer4-3和cer4-4株系探测到CER4mRNA是低水平的，另一方面在cer4-1中没有发现转录产物(Fig.2B)。总体来说，这些结果表明CER4与FAR类基因At4g3370是相同的。Cer4突变株茎秆表皮蜡质的化学和形态学变化我们发现三个拟南芥野生型株系的总蜡质承载量是非常相似的，其范围Ws22。四个突变株系花絮茎秆总蜡质覆20ug/cm-23ug/cmLer和Columbia-0(Col-0;TableI)盖不同于各自的野生型。而且，脂肪酸，醛类，烷烃类，伯醇和酮类的绝对量和相对量在野生型株系之间和cer4株系以及相应的野生型蜡质混合物是存在差异的(TableI;Fig.3)。CER4突变株的复合物类别中伯醇和烷酯类相比于野生型分别减少了2-3ug/cm2和1-4ug/cm2，在突变株系中这些成分仅仅是微量的(TablesIandII)。对cer4-1复合物内长链类型的检测表明个体蜡质复合物成分是没有变化的。最显著的效果是C24，C26和C28伯醇，这三种复合物在四个突变株系的茎秆蜡质中降低到微量。与之相反的是，C30伯醇在cer4-1角质层中是积累的，为野生型水平的16%(Fig.3)。我们在cer4-2和cer4-3发现相似长链类型的伯醇，另一方面在cer4-4中C24和C26醇类表现出显著地降低(datanotshown)。。3欢迎下载精品文档野生型株系的烷酯类表现出的链长度范围在C38-C54之间，并带有一个重要的偶数同系物和大量的C44(TableII)。与之相比较，突变株系cer4-1，cer4-2和cer4-3的偶数酯类水平大幅度降低，而奇数复合物没有表现出此类现象。余下的偶数酯类在C46和C50，C54表现出一个双峰分布。依据质谱分析法（MS）数据显示酯类部分受C45酯类的控制，主要成分是C29醇酯化成的C16:0酸。因为在拟南芥茎秆蜡质中这是一个重要的长链的仲醇，所以这些残留的酯类很可能含有仲醇29烷烃-14-ol和-15-ol。这些醇类在cer4突变株中没有做进一步分析，因为仲醇形成是在无FAR酶类参与的脱羰途径和酰基还原途径。所有酯类的偶数烷烃部分利用MS数据进行了量化，并依据呈现的醇链长度进行了总结。另一方面，Col-0野生型酯类主要由C26烷烃链所占据，在突变体系cer4-1，cer4-2，和cer4-3中这些醇类数量是显著下降的。反之，在他们茎秆蜡质中C22和C30醇类水平是显著增加的，C24和C28醇类也随之变化。cer4-4中的蜡质表明酯类成分介于野生型和其它3种突变体系之间。尽管cer4植株茎秆总蜡质承载量与野生型植株接近，但是4个突变体系的茎秆都表现出光滑。这种现象说明了cer4茎秆角质层蜡晶体受突变的影响。因为之前并没有对cer4植株中的晶体进行过报道，通过扫描电子显微镜检查法我们检测到cer4-1茎秆中蜡晶体的浓度和形状(SEM;Fig.4)。角质层蜡晶体紧密排列组成标注杆，微管，纵向和横向维管束，网状板块覆盖在野生型拟南芥茎秆的表面(Fig.4,AandB)。相反，cer4-1植株茎秆表面几乎缺乏蜡晶体，反而具有一个相对光滑表面的厚蜡质层(Fig.4,CandD)，说明是表层光反射系数变化的原因。假如我们能够提供进一步的证据鉴定出CER4基因，那么我们将通过与At4g33790基因组序列互补作用来改变蜡质的化学成分和表面形态学(Fig.3;TableI)。酵母中CER4的异源性表达为了证实CER4是一个醇形成FAR，并参与长链伯醇产生，我们利用酵母 (Saccharomycescerevisiae)GAL1 启动子表达了1482bpCER4基因的编码区域。在诱导条件下，细胞将转变富含C16：0，C16：1，C18：0，C18：1和CER6：0脂肪酸，而没有探测到脂肪醇类 (Fig.5A) 。相反，酵母细胞表达的 CER4产生了2种新型复合物。利用气相色谱（ GC）和质谱分析（ MS）方法鉴定出它们含有伯醇 CER4：0-OH和CER6：0-OH(Fig. 5B)。CER4表达细胞所积累的 CER26：0脂肪酸表达水平与对照酵母中是一致的。从获得的饱和和非饱和的 C16和C18脂肪酸中未探测到伯醇。在GAL1启动子控制下，利用绿色荧光蛋白（GFP）标记酵母表达的CER4cDNAN-末端，进行了CER4FAR的亚细胞定位。GFP抗原表位与CER4蛋白质的融合，并没有影响到酵母中修饰酶FAR的活性，需要我们利用共焦显微镜做进一步的观察。该试验揭示了酵母 ER的荧光类型(Fig.6A,arrow) 。利用hexylrhodamineB, 进行酵母细胞的复染，该染料能够染色 ER，观察相同的细胞区域 (Fig.6,C –E)，证实了CER4存在于酵母的 ER中。预测的CER4蛋白质特征CER4转录产物编码493个氨基酸多肽，其分子量大约在56.0KD。预测的CER4蛋白质序列与荷荷芭胚胎(Metzetal.,2000)相关的膜依赖型NADPH醇形成FAR的相似度为54%，长度相同(Fig.7)。CER4的序列大部分与拟南芥的MS2（36%氨基酸），其它的拟南芥FAR家族的6。4欢迎下载精品文档个成员的序列相似（31-39%氨基酸，SupplementalFig.S1)。从注释基因数据库中获得了非特异性拟南芥FARs编码序列，随后人为的重注释获得更多的编码学列和推断出来的聚合肽序列。5个拟南芥FARs大小相似于CER4，长度为482-496残基。At3g56700和MS2（At3g11980）具有未知功能的氨基末端，长度分别为 548和516个残基。CER4是拟南芥FAR大部分与荷荷芭FAR描述的生物化学特征密切相关(Fig.1)。CER4与小麦中的另一个特异性蛋白TAA1a高度相关（42%氨基酸），已经证实这个蛋白能够合成初级脂肪醇，对花粉的形成和功能具有重要作用(Wangetal.,2002;Fig.7) 。除此之外，CER4中简短的氨基酸区域功能上大体与蚕类昆虫的信息素腺(Motoetal.,2003)，小鼠的FAR1和FAR2酶功能相同(ChengandRussell,2004;Fig.7)。荷荷芭FAR被认为是一个含有 2个跨膜区域的完整膜蛋白质，跨膜区域分别在 309-329，378-398之间。在这两个预测的片段中 CER4具有相似数量的疏水残基 (Fig.7) 。然而，亲水性图谱和其它的序列分析程序并没有强烈的说明在 CER4蛋白质序列中具有跨膜区域。 所以仍旧不确定是否这些片段是 FAR酶类的跨膜区域。推测的 CER4氨基酸序列缺乏典型的 NAD(p)H绑定位点或罗斯曼折叠： GXGXX（G/A）(Wierengaetal.,1986) 。Aartsetal. （1997）推测MS2通过一个相关的核苷酸绑定序列 (I/V/F)X(I/L/V)TGXTGFL(G/A) 与NAD（P）H绑定，CER4包含这个位点，大约在 19-29残基之间(Fig.7).。5欢迎下载精品文档。6欢迎下载精品文档。7欢迎下载精品文档CER4基因表达分析利用半定量RT-PCR技术来研究CER4基因在不同的组织中的转录水平 (Fig.8) 。取材为6。8欢迎下载精品文档周拟南芥植株的地上组织和 14d种苗的根部组织。 CER4在所有的组织中都表达，但表达水平保持不变。在开放的花朵和根部中转录产物积累水平最高。 在茎秆，闭合花朵和长角果中的转录水平中度；检测到 CER4转录产物在丛生和茎叶中发现最低。为了更细节的分析 CER4的细胞表达类型，将 CER4编码区域的上游 2.1kb基因组序列融合一个β-葡萄糖醛酸酶(GUS)报告基因(GUS)(CER4pro:GUS)，构建之后用于拟南芥的转化。来自20个独立转基因株系的组织样品用活跃的GUS进行标记，其中对4个株系特征进行了详细的描述。报告基因在嫩枝和根部都表达，这与RT-PCR分析相一致(Fig.9)。在茎秆的表皮细胞中，CER4被完全表达(Fig.9,AandB)。通过原位杂交，我们证实了CER4在花朵的上表皮特异性表达(Fig.9C)，还发现CER4表达仅仅限制在嫩枝和花分生组织的下端区域。在莲座叶毛状体的表皮细胞，CERpro：GUS强烈表达(Fig.9E)。叶片限制性表达类型或许解释了在整个叶片组织中CER4转录产物低水平表达，因为这些转录产物将通过扁平细胞和潜在的叶肉细胞而减弱。CER4在茎叶中的表达更为普遍，并在毛状体，扁平细胞和脉管系统也被探测到，尤其在叶片基部高表达（Fig8）。在花朵的花瓣，雄蕊花丝和心皮中探测到CER4pro-GUS活性(Fig.9F)。CER4转录产物的原位杂交证实了其在心皮中表达，这种表达方式为表皮特异性(Fig.9G)。在长角果中CER4pro：GUS活跃于长角果的外层，但是在种子中不活跃(Fig.9H)。意外的是，我们在14d种苗根中央和外层也探测到了CER4的表达(Fig.9I)，而在根尖中未探测到(Fig.9J)。CER4在根尖后的延长区域的表达是强烈的，而在分生区域的老化部分表达减弱(Fig.9I)。尽管表皮细胞GUS染色比内部细胞更明显一些在延长区域的所有细胞类型中探测到了GUS活性(Fig.9K)。讨论野生型拟南芥茎秆总蜡质沉积中伯醇成分为 10%-15%，叶片中自由醇或者腊酯为15%-25%。CER4突变株的茎秆和叶片几乎终止了伯醇的形成，表明CER4是催化生物合成的关键酶。在这项研究中，我们利用cer4克隆到了CER4(At4g33790)基因，描述了在蜡质产生过程中CER4的功能。CER4（At4g33790）基因编码分子量为56KD的蛋白质，与报道的荷荷芭和豌豆FAR酶数值相似(VioqueandKolattukudy,1997;Metzetal.,2000)，与荷荷芭蛋白质的序列相似。FAR酶催化酯酰CoA为底物的硫代酸酯的裂解，以及借助NAD（P）H辅酶转移电子将脂肪酸还原成醇类的反应。为了直接的评价CER4FAR还原酶的活性，进一步的研究其底物特异性，我们将CER4cDNA在酵母中进行表达。CER4表达的酵母积累了C24和C26特异性长链醇类。野生型酵母细胞也产生了鞘脂类合成C20和C22脂肪酸。然而，在CER4表达载体中未探测到C20和C22自由醇，表明这些酰基可能不是CER4FAR的底物和CER酶所必需。短链醇的缺乏，特别是C16和C18，表明CER4不能利用丰富的饱和和非饱和的C16和C18酯酰CoA作为底物。这与蚕类昆虫的FAR相反，当它们在异源酵母中表达后产生了C16和C18脂肪醇(Motoetal.,2003)，荷荷巴中的FAR，当在细菌中表达是产生了C16:0和C18：1脂肪醇(Metzetal.,2000)。酵母转化株表达的CER4FAR不能产生蜡酯，表明至少在酵母细胞中CER4不能从产生伯醇形成蜡酯。酵母中CER4底物特异性显现出cer4突变株确立的蜡质图谱与预先报道的一致，缺乏C24和C28自由醇(Hannoufaetal.,1993;McNevinetal.,1993;Jenksetal.,1995)。然而，cer4突变株仍旧积累大量的C30醇类，表明额外的FAR同工酶可能参与它们的产生。除了MS2以外，一个膜状层特异性蛋白石花粉形成所必须的(Aartsetal.,1997)，其它的6个拟南芥FAR同工酶的功能是未知的。微阵列分析表明这些基因中的5个表达被限制在特异性组织类型中，另一方面1个是被广泛的表达(Schmidetal.,2005)。当然，仅仅有At3g56700在茎秆中高度表达，所以其也是产生C30伯醇的候选基因。正如我们所期望的，在cer4突变株。9欢迎下载精品文档的烷酯成分由于C24-C28伯醇的缺乏而受到重要影响，这些伯醇主要被用来蜡质合成到产生表皮烷烃酯。有趣的是，尽管伯醇和烷酯水平大量的降低，cer4突变株几乎是野生型茎秆蜡质沉积(TableI)，然而它们的茎秆还具有光泽的。对Cer4茎秆表面SEM研究表明，它们由相对光滑薄膜所覆盖，而缺少蜡质晶体，形成光滑的茎秆表面。这些数据表明伯醇和腊酯是角质层蜡晶体形成所必需的。不太可能的是，蜡晶体本身是由两种单独的腊酯成分形成的，因为烷烃类，仲醇和酮类组成了拟南芥茎秆沉积(approximately75%)的主要部分，也是晶体形成的主要成分。所以，对于缺乏酰基还原产物怎样阻碍了蜡晶体形成的机理还不是很清楚。在茎秆的表皮细胞中唯一的探测到CER4转录产物。在cer4突变株的表现型中期待CER4在嫩芽表层中的表达，这个突变株缺乏角质层蜡沉积在茎秆的表面的伯醇。这就表明至少在茎秆中，CER4伯醇功能是形成表皮蜡质。CER4也在叶片表皮细胞中表达，但是在莲座叶中仅限制在毛状体细胞类型中。在毛状体中发现了CER2(Xiaetal.,1997)和WAX2/YRE1(Kurataetal.,2003)的特异性表达。我们分析了4个缺乏腺毛突变株gl1,gl2,gl3和ttg1，奇怪的是不能探测到伯醇的水平(datanotshown)。另外还要求我们确定在这些突变株中是否CER4基因表达会发生变化，是否在野生型莲座叶叶片植株表皮细胞CER4低水平表达会产生大量的伯醇。可能的是发育的叶片中CER４高水平表达比我们检测的要早一些。在后者，在叶片发育过程中伯醇形成比较早。发现在根的伸长区域CER４高水平表达，转录产物出现在所有的细胞类型中。我们根部的表达数据与获得的拟南芥原位信息相一致(Birnbaumetal.,2003)，定位在表皮，中柱，内皮的延长和分生区域CER４表达信号是最高的。几个其它的表皮相关基因转录产物也在根组织中被探测到，命名为：FDH(Yephremovetal.,1999;Pruittetal.,2000)LACS2(Schnurretal.,2004),ACE/HTH(Krolikowskietal.,2003;Kurdyukovetal.,2006a),CER5(PighinandZhengetal.,2004),andBDG(Kurdyukovetal.,2006b)，表明保护性脂质层类似于角质层沉积在根细胞的细胞壁中。通过共焦显微镜检测酵母中活跃的GFP标记的CER４结果显示，FAR定居在ER中。醇-形成FAR的ER定位建议为荷荷巴胚胎酶，位于细胞膜内与ER膜碎片相关(Metzetal.,2000)。尽管我们试图来表达拟南芥中功能性GFP标记的CER4并没有取得成功，CER4被定位在植物的内质网上也是有可能的，这种定位方法还需要继续研究。CER4FAR是第一个蜡生物合成酶类随后的脂肪酸延长的亚细胞定位还有待确定。利用GFP融合技术将脂肪延长酶的成分为CER6，是一种缩合酶，CER10是一个烯酰-CoA还原酶定位在ER中(KunstandSamuels,2003;Zhengetal.,2005)。存留的问题为是否酯酰还原途径从自由脂肪酸和伯醇中产生烷酯类的最后阶段，被限定在ER中，是否烷酯类在另一个细胞区室内形成。类似地，还没有有效的鉴定出脱羰途径的酶类，所以这个途径的定位需要被确定。 未来对于ER膜相关CER4的性质需要进一步的研究。跨膜预测不能清晰的探测到 CER4的跨膜区域，猜测跨膜区域为其它的 FARs也不是很强烈，也不是保守的 (Metzetal.,2000;Wangetal.,2002;O.Rowland,unpublisheddata)。CER4或许是其它的 FARs，通过其它的反式与膜相关，比如作为一个转移附着酯类也是可能的。总之，我们已经克隆出了拟南芥蜡缺乏cer4突变株干扰的CER4基因，表明CER4编码一个ER定位的FAR。CER4特异性的参与C24和C28长链伯醇的产生，这也是拟南芥嫩枝中角质层蜡的主要成分。材料和方法植株材料和生长条件SALKT-DNA插入株系，SALK-038693和SALK-000575(Col-0生态型)，和cer4-1(Ler生态型)突变种子是从ABRC中获得的。cer4-2（Ws生态型）是Dr.BertrandLemieux(YorkUniversity) 由惠赠的。将种子在 4℃下休眠3-4d，然后在持续的。10欢迎下载精品文档光照下(100mEm22s21ofphotosyntheticallyactiveradiation)20 ℃AT-培养皿(SomervilleandOgren,1982) 中萌发。将10d的幼苗移栽到土壤中 (SunshineMix5;SunGro)，22℃长日照条件下生长 (16-h-light/8-h-darkcycle) 。蜡质的提取和分析确定蜡质的积累大约在拟南芥植株 6周大的时候(Arabidopsisthaliana) 。将茎秆，叶片和角果浸没在氯仿中 30s以去除表面和角质层内的蜡质。提取之后，将蜡样本在氮蒸汽下蒸干，利用50ulN,O-三氯乙酰氨（BSTFA）1%三甲基氯硅烷（TMCS）溶解，80℃下萃取90min。依照Pighinetal.(2004).描述利用气-液相色谱进行样本的分析。利用火焰离子化检测器获得的峰值进行复合物的量化，通过与内标量进行比较转化为质量单位， 17：1甲酯，添加到每个样本中优先提取。对于蜡酯的分析，将野生型拟南芥和 cer4突变株茎秆表皮蜡质混合物通过硅胶薄层分析，并利用1,1,1-三氯乙烷作为移动相进行分离。通过利用樱草灵染色和UV定位复合物的分类，脱盘，CHCl3洗涤，过滤，N2收集，储藏于4℃。部分烷基酯(Rf0.13)经受细节性的GC分析。利用AGC火焰离子化检测器来量化酯同系物的相对数量，另一方面基于酰基 -RCOOH2+利用GC-MS来确定每个长链蜡质的异构体组分。SEM利用SEM收集柱将茎秆顶端的 1cm片段进行收集后烘干，然后利用 SEMPrep2装置的金属颗粒包裹(Nanotech)。包裹的样本利用 HitachiS4700 电场发射SEM进行观察，电压为 1kV，距离为12mm。蛋白质序列和系统进化分析利用ClustalW1.83 程序的默认参数来比对蛋白质序列 (Thompsonetal.,1997) 。利用 进行平面图的打印。利用ClustalX1.83BLOSUM矩阵和默认参数比对蛋白质并构建系统进化树的构建 (http://bips.u-strasbg.fr/fr/Documentation/ClustalX) 。利用ClustalW1.83 程序通过邻接法产生系统树。Cer4表现型的分子互补将从野生型Ler植株中分离出来的基因组DNA的一个6138bpDNA片段含有At4g33790编码区域，通过PCR进行扩增。这个片段含有5’端ATG起始密码子2160bp和3’端终止密码子438bp。用来扩增的引物为At4g33790-PromEcoRI(5’-GAGGAATTCTTTCCTTGTAGCCGCCTTTA‘)-和3At4g33790-TermXbaI(5’-GAGTCTAGAAACTTTACATGGGGGCAATG‘)。-为3了减小PCR的诱导误差，利用高保真PCR系统进行扩增(RocheDiagnostics)。利用ECOR1和Xba1将扩增片段进行消化，克隆相对应的 pRD400(Datlaetal.,1992). 将构建的pRD400/At4g33790通过电穿孔转化到AgrobacteriumtumefaciensstrainGV3101(pMP90) ，利用花序浸渍法 (CloughandBent, 1998)进行cer4-1拟南芥植株的转化，在含有 30ugmL-1kan(w/v)的AT-琼脂板筛选转化株。酵母中CER4的表达和亚细胞定位我们首先分离出在酵母中表达的全长 CER4cDNA(Saccharomycescerevisiae) 。依据说明利用TRIzol试剂从野生型的 Col-0植株中提取总 RNA。利用总RNA1ug,oligo(dT)18,和SuperScript II 反转录试剂盒 (Invitrogen) 合成第一条cDNA。利用1ulcDNA高保真延伸PCR系统来扩增CER4cDNA。扩增的引物为 CER4-F5BamHI(5‘-GAGGGATCCATGTCGACAGAAATGGAGGTC‘)和-3CER4-R7SacI(5’-CACGAGCTCTTAGAAGACATACTTAAGCAGC‘)。-利3用BamHI和SacI消化扩增的DNA片段，然后克隆响应的pBluescriptIISK+ 位点，产生pBS/CER4.个体序列的克隆证实了 CER4cDNA无错误。利用EcoRI和Ecl136II 消化pBS/CER4,酵母表达载体p423-GAL1(Mumbergetal.,。11欢迎下载精品文档1994)EcoRI和EcoRV之间的限制性位点，产生 p423-GAL1/CER4.依照GietzandWoods(2002) 将p423-GAL1/CER和空载体p423-GAL1转化到酵母菌株W3031A(MATaade2-1his3-11,15leu2-3,112trp1-1 ，ura3-1can1-100) 中，培养在缺乏His的迷你平板中。将单个的酵母转化株转移到含有2%GaL的琼脂平板上诱导CER4的表达。在提取脂肪之前将这些平板放置于30℃下培育6d。对于总脂肪的提取，从平板中将酵母细胞刮落大棚1ml的乙醇中。5min后，添加2mL氯仿并混匀。再过5min后，加入0.9%NaCl0.75mL。随后进入分离相，将氯仿相转移到新鲜的柱子中。将样本在 N2下蒸干，然后利用 BSTFA添加1%TMCS后蒸馏，通过先前描述利用气 -液色谱法对植株蜡质进行分析。为了将GFP融合到CER4的编码区域中，利用BamH1和Sac1消化pBS/CER4,并克隆到二元载体pVKH18-GFPN(Zhengetal.,2005)的相应位点上，形成pVKH18-GFP-CER4。酵母中GFP-CER4的表达，在pVKH18-GFP-CER4中GFP-CER4的编码区域释放了一个XbaI-Ecl136II片段，将酵母表达载体p423-GAL1位于spe1和EcoRV之间进行克隆 (Mumbergetal.,1994), 产生p423-GAL1:GFP-CER4.将这个质粒转化到酵母菌株的 W3031A中，诱导GFP-CER4的表达。对于亚细胞定位，按照 Zhengetal.(2005) 描述通过共焦显微镜检测 GFP和hexy1玫瑰红B荧光。在分析之前将酵母细胞浸泡到玫瑰红 B溶液中30min。半定量RT-PCR分析收集6周拟南芥植株地上部分并提取总 RNA。收集生长在AT-琼脂盘中持续光照 14d种苗的整个根组织。除了长角果组织以外，利用异硫氰酸呱 -HCl和苯酚-三氯甲烷提取方法来提取总RNA(Logemannetal., 1987)。利用acid phenol-LiCl 提取程序分离长角果的 RNA(Downingetal.,1992) ，再利用3M醋酸钠，pH5.2冲洗末端去除多余的糖类。通过RT-PCR来分析CER4转录产物，利用1ug总RNAoligo(dT)18, 和SuperScript II 反转录试剂盒为模板进行反转录。用一个 1:1稀释的R