微量中和实验齐立

微量中和实验齐立第一页，共三十二页，2022年，8月28日

采集临床标本

采集急性期和恢复期双份血清

快速诊断病毒分离RT-PCRHAI或微量中和实验试剂盒（MDCK或EGG）

测序

CPE+HA+

HAI(WHOFLUH5KIT)直接进行抗原检测疫情爆发第二页，共三十二页，2022年，8月28日微量中和实验的优势一、传统的流感病毒中和实验主要基于对MDCK细胞病变抑制作用观察，即费时又费力。结合感染细胞快速鉴定方法，改进后的中和实验可以在两天内完成，并可一次测定大量血清样品二、微量中和试验技术已被成功应用于检测血清中抗流感病毒甲5型抗体，并可以推广用于检测血清中其它抗禽流感病毒亚型中和抗体水平，其敏感性高于血凝抑制试验。三、由于人群中缺乏抗禽流感病毒特异性抗体，因此，检测单份血清即可反映人群的免疫状态。但是当诊断可疑病患时，则需要同时检测急性期和恢复期双份血清中的中和抗体滴度，若恢复期血清抗体水平高于急性期（4倍）即可确立诊断。第三页，共三十二页，2022年，8月28日实验原理1抗原抗体之间的中和反应1：20DILUTION1：40DILUTION1：80DILUTION1：160DILUTIONHA抗原血清中的中和抗体第四页，共三十二页，2022年，8月28日2ELISA的实验原理MDCK细胞中的病毒核蛋白（NP）抗原NP-AG鼠抗流感病毒甲型核蛋白单克隆抗体

NP-AB病毒核蛋白抗原-核蛋白单克隆抗体复合物辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IGG磷苯二胺第五页，共三十二页，2022年，8月28日实验材料一、中和反应的实验材料（一）病毒

1）当使用甲5型病毒时，9-10日龄的SPF胚较好，一般在37℃培养26-28小时会得到较高的滴度，一般血凝滴度在128以上方可用于中和实验

2）冻存的病毒不能重复使用

3）进行中和实验前，需先进行病毒滴定（TCID50）的滴定进行病毒定量第六页，共三十二页，2022年，8月28日（二）血清样品

1）收到的被检血清要分装多份，冻存于-20℃，一般不要反复冻融3次以上。

2）血清样品包括待检血清和阳性以及阴性对照血清，人血清实验前需56℃灭活30分钟分钟，动物血清需要RDE处理分装，去除非特异性抑制因素。（三）MDCK细胞和细胞培养试剂

1）MDCK细胞（狗肾上皮细胞）早代的细胞（〈10代）以及处于对数生长期的细胞对病毒感染具有最大的敏感性（在细胞培养皿中70%-90%）成片

2）细胞培养液DMEM牛血清抗生素

3）用于细胞消化的胰酶和VERSON第七页，共三十二页，2022年，8月28日二ELISA实验材料1,抗体1鼠抗流感病毒甲型核蛋白单克隆抗体2.抗体2:辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IGG3.洗涤液:PBS+0.05%TWEEN-204.封闭液:PBS+1%牛血清白蛋白+0.05%TWEEN-205.底物和底物溶液:

常用的辣根过氧化物酶(HRP)所用的底物为磷苯二胺(OPD)

底物溶液为PH5.0磷酸盐-柠檬酸缓冲液6.终止反应液第八页，共三十二页，2022年，8月28日质量控制病毒中和实验技术是一个相当复杂的过程，参与中和反应的因素有病毒、抗血清和宿主细胞，这些因素的变化都会影响中和试验的结果。因此，须对中和试验的整个过程进行严格的质量控制，每次测定必须设立阳性和阴性血清对照，阳性和阴性细胞对照，以及对病毒使用剂量进行滴定第九页，共三十二页，2022年，8月28日一．

血清对照血清对照包括人或动物血清阳性和阴性对照。即血清中含有（阳性对照）或不含有（阴性对照）对测定病毒特异性的中和抗体。血清对照一般分装成多份，-20℃保存，并避免反复冻融使用。1．阴性血清对照（1）

动物血清一般来自未免疫或未感染动物，即与待检血清同种动物的正常血清。（2）

人血清一般来自与待检血清年龄相同的正常人群，该人群未暴露于待检病毒。（3）

测定过程中，阴性对照血清与待检血清应处于相同稀释水平。2．阳性血清对照（1）

动物血清一般来自免疫后或感染后动物。（2）

人血清一般采用急性期和恢复期双份血清做对照。*人血清使用前须经加热灭活处理，动物血清则须经霍乱滤液RDE（即受体破坏酶）处理，以排除非特异性反应因素。第十页，共三十二页，2022年，8月28日二．

病毒和细胞对照

每次试验必须设立阳性和阴性细胞对照，以及对加入病毒工作液进行滴定检查，以便获得准确可靠的实验结果。第十一页，共三十二页，2022年，8月28日BCDEFGH细胞对照病毒对照回滴A血清阴性对照血清阳性对照123456789101112质量控制第十二页，共三十二页，2022年，8月28日实验步骤

该实验分为三个步骤：（1）病毒滴定（2）病毒中和试验（3）酶联免疫吸附实验（ELISA）。一病毒滴度测定（组织培养半数感染量TCID50滴定）（一）

流感病毒制备利用鸡胚尿囊腔接种法制备流感病毒，收获尿囊液，血凝试验测定病毒的存在，分装后-70℃冻存。（二）

病毒的稀释1．

取1管冻存病毒尿囊液，1：100稀释（100微升病毒液+9.9毫升稀释液）第1排加入146微升1：100稀释过的病毒液，然后做系列半对数稀释，使之成10-2、10-2.5、10-3、10-3.5……10-7。每孔含100微升病毒液，每个稀释度重复4孔。（三）

MDCK细胞的准备1．

用病毒稀释液将细胞稀释成1.5X105细胞/毫升。2．

加100微升细胞（1.5X104细胞/孔）于已稀释好病毒的微量培养板中。3．

在37℃5%CO2温箱中培养18-22小时。

第十三页，共三十二页，2022年，8月28日-BCDEFGH加入146ul病毒稀释液46ul46ul46ul46ul46ul46ul46ul46ul46ul46ul弃掉46ul-TPCK-trypsin+TPCK-trypsin无病毒的稀释液A123456789101211病毒TCID50滴定方法第十四页，共三十二页，2022年，8月28日（一）

测定组织细胞半数感染剂量（TCID50）1．

弃去微量培养板中的细胞液，250微升PBS洗细胞一次。2．

弃去PBS（不要让细胞干燥），加入100微升/孔固定液。3．

覆盖微量培养板，于室温固定细胞10分钟。4．

弃去固定液，让微量培养板室温干燥。5．

用ELISA检测细胞感染6．利用ELISA检测仪，于490纳米波长，测定每孔吸光度（OD）值，计数细胞阴性对照的平均OD值。7．

若含有不同稀释度病毒孔平均OD值是细胞阴性对照孔平均OD值的2倍以上，则判断为病毒生长阳性。8．根据Reed和Muench方法对病毒滴度进行核算，最终获得TCID50/100微升。9．在进行中和试验前，稀释病毒液，使之50微升中含有100TCID50流感病毒。第十五页，共三十二页，2022年，8月28日TCID50值的计算一般使用Reed-Muench方法计算。稀释（1）（2）（3）（4）（5）（6）阳性阴性阳性数阴性数比率%阳性数1044011011/11100104.540707/710010531313/475105.504050/501．计算各病毒稀释度阳性孔数目（1）和阴性孔数目（2）2．计算阳性和阴性孔的累积数：阳性孔累积数由下向上累积（3）；阴性孔累积数由上向下累积（4）3．计算阳性孔的百分比：比率（5）=（3）/[（3）+（4）]，（6）=（5）X1004．计算距离比例距离比例=（大于50%的阳性百分比-50）/（大于50%的阳性百分比-小于50%的阳性百分比）

=（75-50）/（75-0）=0.3第十六页，共三十二页，2022年，8月28日TCID50的对数=大于50%的阳性百分比的最高稀释稀释对数+距离比例X稀释系数的对数=5+0.3X0.5=5.15TCID50=10-5.15/100微升100TCID50/100微升=10-3.15100TCID50/50微升=10-3.15/2=10-3.15+0.3=10-2.8=1:631第十七页，共三十二页，2022年，8月28日1加入血清2倍稀释2加入病毒100TCID50/孔2h37℃

3加入ＭＤＣＫ细胞１．５×１０４／孔１８h37℃４洗板固定５ＥＬＩＳＡＮＰ特异性抗体流感病毒微量中和实验步骤第十八页，共三十二页，2022年，8月28日BCDEFGH细胞对照病毒对照回滴血清ASYDSADK/SINGX-49N123456789101112流感病毒微量中和实验设计第十九页，共三十二页，2022年，8月28日905050505050505090909090

90

909090905050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505010010050501005010050505050505050505050505050BCDEFGH细胞对照病毒对照回滴血清ASYDSADK/SINGX-49N123456789101112流感病毒微量中和实验加样方法第二十页，共三十二页，2022年，8月28日50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul弃掉50ul10050505050505050100100100100100

1001001001001005050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505010010050501005010050505050505050505050505050BCDEFGH细胞对照病毒对照回滴血清A加入10UL血清,从A1-A10

SYDSADK/SINGX-49N123456789101112加入100UL病毒到A11第二十一页，共三十二页，2022年，8月28日50505050505050505050505050

50505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505010010050501005010050505050505050505050505050BCDEFGH细胞对照病毒对照回滴血清ASYDSADK/SINGX-49N1234567891011122倍稀释后的情况A-1-----A-111:1001:2001:4001:800

1:1600

1:3200

1:64001:12800第二十二页，共三十二页，2022年，8月28日100100100100100100100100100100100100100

1001001001005010010010010010010010010010010010010010010010010010010010010010010010010010010010010010010010010010010010010010010010010010010010010010050100100501001001005010010010010010010010050100100501001001001001001001005050100100100100100BCDEFGH细胞对照病毒对照回滴血清ASYDSADK/SINGX-49N123456789101112加50UL(100TCID50)病毒于浅兰色孔100TCID50502512.56310.5第二十三页，共三十二页，2022年，8月28日100100100100100100100100100100100100100

100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100BCDEFGH细胞对照病毒对照回滴血清ASYDSADK/SINGX-49N123456789101112加50UL稀释液于A-11100TCID50502512.56310.52小时后第二十四页，共三十二页，2022年，8月28日200200200200200200200200200200200200200

200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200BCDEFGH细胞对照病毒对照回滴血清ASYDSADK/SINGX-49N123456789101112所有各孔均加入100ULMDCK细胞(1.5×104)培养18-22小时100TCID50502512.56310.51:2001:4001:8001:16001:32001:64001:128001:25600第二十五页，共三十二页，2022年，8月28日中和实验结果判定0.7120.701

0.1120.096

1.4531.7521.495.1.1360.9790.971

0.7921.4240.6380.567

0.0930.095

0.0610.7600.9630.9430.8170.940

0.7491.2950.931

0.681

0.0940.105

0.9950.9930.9681.0400.9420.951

0.5151.3210.759

0.732

0.1370.101

0.9750.9661.1490.9250.8460.925

0.3461.2290.800

0.986

0.1820.174

1.0330.9971.0440.9250.9820.9650.1580.1020.756

0.725

0.4740.356

0.9820.9750.9780.7510.8770.9100.0980.1100.739

0.778

0.5510.628

0.9130.9450.9430.9230.7240.8490.1560.1230.968

0.958

0.9811.059

1.1041.0940.9411.0791.0751.0110.1000.093

SYDSADK/SINGX-49NVCCC(+)1.33(-)0.1120032006400128002560040080016001)X=1.33-011/2+0.11=0.72(细胞半数感染域值）2）低于1.1的细胞孔判定为中和反应阳性中和反应阳性的血清最高稀释度即为血清中的中和抗体的滴度Y=OD（)2=0.22第二十六页，共三十二页，2022年，8月28日0.1550.128

0.2250.256

2.0202.1222.2162.0841.6801.721

1.5462.1400.1300.134

0.4840.702

1.8251.9121.9871.6781.6341.884

1.4401.999O.1530.185

1.3061.1261.9661.9051.9811.8491.7761.888

0.9292.0780.2230.202

1.8231.5861.8091.9321.9701.9111.9531.821

0.6512.0380.3640.414

1.8461.7381.7642.1701.9051.9002.0431.967

0.6090.0780.6730.694

1.7761.7851.7312.1452.0141.7121.7971.723

0.4530.0831.1771.204

1.9891.6961.8461.9972.0191.7911.8561.856

0.2420.0921.7011.531

1.7461.6231.7171.8511.9201.7201.7872.0280.1360.083(+)2.1(-)0.081)X=2.1-0.08/2+0.08=1.1(细胞半数感染域值）2）低于1.1的细胞孔判定为中和反应阳性中和反应阳性的血清最高稀释度即为血清中的中和抗体的滴度Y=OD（)2=0.222004008001600320064001280025600SYDSADK/SINGX-49NVCCC第二十七页，共三十二页，2022年，8月28日操作中注意的事项1．待检人血清需56℃30分钟灭活，动物血清需RDE处理。2．待检血清需要重复测定时，应分装后冻存，以免反复冻融。3．每管病毒只使用一次，若重复使用，或血清阳性对照结果过高或过低，以及细胞阳性对照OD值过低，须对病毒进行重新测定。4．MDCK细胞应处于对数生长期，严禁细胞过度生长或老化（代数过高）。因此，必须在10代前进行细胞冻存，保存于液氮中备用。5．牛血清有中和病毒感染力的作用。试验过程中切勿将细胞培养液与病毒稀释液混淆使用。第二十八页，共三十二页，2022年，8月28日6．病毒与抗血清混合，常规采用37℃作用1小时，该试验采用37℃作用2小时，但针对不同耐热性的病毒，孵育温度和时间应有所增减。7．在ELISA过程中，每步都要洗涤，以保证结果可靠。8．选择合适的抗体稀释浓度，一般预先将不同稀释度的抗体以及酶结合抗体进行ELISA测定，以获得最佳稀释度。9．正确控制显色时间，以降低背景染色。10.大量测定时，为稳定培养液的PH值，可用HEPES增加溶液的缓冲能力，减少PH变化对细胞的不利影响。11.

在缺少病毒特异性抗体的情况下，可用细胞病变观察或检测微量培养板中每孔血凝活性来替代ELISA方法。但细胞培养时间一般须从18-22小时增至2-4天。

第二十九页，共三十二页，2022年，8月28日总结一、病毒微量中和实验（第一天）（一）

实验设计取一96孔微量培养板，标记：细胞阳性和阴性对照孔，血清阳性和阴性对照孔，待检血清孔，以及病毒工作液