实验二转座子随机突变及目标表型的筛选

实验二转座子随机突变及目标表型的筛选第一页，共二十四页，2022年，8月28日实验内容♣

染色体步移法克隆已知序列的侧翼序列♣转座子随机突变及目的表型的筛选♣大肠杆菌β-半乳糖苷酶的诱导♣利用SDS分析融合蛋白的可溶性♣绿色糖单胞菌的发酵及孢外酶的提取第二页，共二十四页，2022年，8月28日转座子随机突变及目的表型的筛选李丽萍第三页，共二十四页，2022年，8月28日实验目的1.了解细菌常见转座子Tn5的结构及转座机理2.学习利用转座子进行随机插入突变的实验过程3.掌握双亲接合实验的原理及过程第四页，共二十四页，2022年，8月28日实验原理转座子：转座因子或跳跃因子，它可以从遗传物质的一部分跳跃到另一部分，从而引起遗传变异。转座子的发现：20世纪50年代初期，美国冷泉港实验室遗传育种学家McClintock通过对玉米籽粒色斑不稳定现象的研究而发现转座现象，首次发现了能在基因组内不同区域转移的控制成分。第五页，共二十四页，2022年，8月28日实验原理细菌转座子的类型：插入序列(Insertionsequence);复合转座子(Compositetransposons);Tn5TnA转座子家族(TnAfamily);可移动噬菌体(Muphage).第六页，共二十四页，2022年，8月28日实验原理Tn5：发现于E.coli，序列全长5818bp。核心序列：编码三个抗生素(新霉素、博莱霉素、链霉素)；

两个倒置的IS50：IS50R编码53KD的Tnp和48KD的转座阻遏蛋白(Inh),两者使用同一阅读框，但启动子不同。IS50L的第1442碱基处存在一个赭石突变，IS50具有19bp的倒置末端，二者有7个碱基不相同，是转座酶(Tnp)的作用位点。kanrstrrbleorOEIEIEOEIS50LIS50RP1(Tnp)P2(Inh)P3P4突变位点(Mutationsite)第七页，共二十四页，2022年，8月28日Tn5的转座机理第八页，共二十四页，2022年，8月28日第九页，共二十四页，2022年，8月28日第十页，共二十四页，2022年，8月28日实验原理第十一页，共二十四页，2022年，8月28日实验原理DNAsequencing第十二页，共二十四页，2022年，8月28日实验原理非转移性质粒：转移性质粒：能自动地从一个细胞转移到另一个细胞，甚至还能

带动供体细胞的染色体DNA向受体细胞转移;接合作用：质粒在细菌间的转移，需要供体和受体细胞间的直接

接触才能进行.受体菌，ApNx巴西固氮螺菌Sp7供体菌S17-1质粒pRL1063a,Km重组巴西固氮螺菌，ApNxKm第十三页，共二十四页，2022年，8月28日实验原理植物生长激素，由植物根系细菌合成，对植物的生长及一些发育阶段的调控起关键作用细菌中IAA合成的几种途径A-B：吲哚乙酰胺途径；E-F-D：吲哚丙酮酸途径；C-D：色氨酸侧链途径第十四页，共二十四页，2022年，8月28日第十五页，共二十四页，2022年，8月28日实验材料菌株E.coliS17-1/pPRL1063a;巴西固氮螺菌sp72.培养基及试剂(1).细菌丰富培养基LB培养基LD培养基胰蛋白胨(g)1010酵母提取物(g)55氯化钠(g)102.5pH7.06.8固体培养基加入1.3%琼脂粉，dH2O定容至1L，121℃灭菌20min第十六页，共二十四页，2022年，8月28日(2).用于IAA摇瓶培养的培养基(MAZ培养基)第十七页，共二十四页，2022年，8月28日(3).抗生素抗生素名称贮存液配制方法氨苄青霉素(Ap)100mg/ml水溶液，-20℃25μg/ml卡那霉素(Km)100mg/ml水溶液，-20℃50μg/ml30-50μg/ml萘啶酮酸(Nx)20mg/ml水溶液，-20℃5μg/mlE.coli

A.brasilense使用浓度3.主要仪器

小型离心机第十八页，共二十四页，2022年，8月28日实验步骤第一天：中午12：30～13：30接种sp7至5mlLD液体培养基中，30℃振荡培养约20小时。晚5：30，接种供体菌pRL1063a/E.coilS17-1至5mlLB+Km液体培养基中，37℃振荡培养约16小时。第二天：上午9：00，用同一个1.5ml离心管收集适量供体菌和受体菌。12000rpm离心30sec，弃上清，用移液器将菌泥悬浮混匀后移入LD平板中央，尽量减少气泡的产生。30℃正置培养过夜。注意：事先准备好LD平板

第十九页，共二十四页，2022年，8月28日第三天：用液体LD培养基洗下菌泥，铺于同时含有Km、Ap、Nx的LD平板上，30℃培养，筛选接合子。第四天：挑取接合子在含有上述三种抗生素的LD培养基平板上划线分离，保证得到的为单菌落。第五天：挑单菌落分别接种于5mlMAZ培养基中30℃摇瓶培养（野生菌对照）.第二十页，共二十四页，2022年，8月28日第六天：用比色法测定菌液中的IAA含量。比色试剂：含12g/LFeCl3

的H2SO4注意安全取1ml测量OD600；取1ml菌液12000rpm离心5min后取上清与比色试剂等量混合，摇匀后在暗处放置30min，然后测OD540nm注：空白对照，未接菌的培养基与比色用试剂的混合液。第二十一页，共二十四页，2022年，8月28日标准曲线第二十二页，共二十四页，2022年，8月28日实验结果菌株(Strains)

(OD600)(OD