省队培训生化与分子第五章基因表达

第五章遗传信息的表达

DNA是绝大数生物遗传的物质基础，是生物体内最主要的信息分子。它通过转录和翻译指导蛋白质的合成，从而决定细胞结构和功能的特征。另一方面，通过自身复制将遗传信息从亲代传给子代，此全部过程称为生物学的中心法则。即：

DNARNA蛋白质复制复制转录反转录翻译第一节DNA的合成

DNA的生物合成有三种方式：一种是以DNA为模板的指导的DNA合成为DNA复制，二种是以RNA为模板的指导的DNA的合成为逆转录。三是DNA的损伤与修复。

一.DNA复制的基本机制与过程

1.复制机制

2.DNA复制起点和复制子

DNA复制在生物细胞中要从DNA分子上特定位置开始，这个特定的位置称为复制起点(originofreplication---ori.)用ori表示。复制的起始点的结构都是特殊的。在原杭生物中，如E.coli,肺炎杆菌等，复制的起始区域均有GATC和TTATCCACA顺序的多次重复。在病毒DNA的复制起始区中，在两个G—C富含区之间有一个A—T富含区。真生物复制的起始区的结构也是特定的。如E.coli染色体DNA复制起始点OriC。它由422bp的DNA片段组成。其结构特点为：

(1)在oriC区域内有一系列对称排列的反向重复序列，即回文结构（指一段正读和反读的意义均相同的文字，在核酸结构中则指一段走向相反顺序相同的DNA顺序），这表明该区域与DNA的复制酶系统的识别有关。(2)在OriC区中还有两个转录启动子的核苷酸序列。这暗示了转录可能在E.coli染色体DNA复制起始时起着重要的作用。DNA的复制从起始点开始直到终点为止，每一个这样的DNA单位称为复制子或复制单元。在原核生物中，由于DNA是单起始点复制，因此每个DNA分子就是一个复制子。而在真核生物中，每个DNA分子有许多复制起始点（多起始点），即每个DNA分子上有许多个复制子，每个复制子长约50—200kb，因此，真核细胞DNA的复制是由许多复制子共同完成的。

3.复制的方向和方式

大多数生物的DNA复制是以双向复制的形式形成两个复制叉，复制叉的移动是双向等速的，其中一条链的复制是连续的（一条是连续的，即模板链3’—5’链，与复制叉移动方向一致。另一条链是不连续的，即模板链5’—3’链，与复制叉移动方向相反）。但是也有例外，如枯草杆菌DNA复制时，复制叉的移动不是等速的，一个复制叉先移动DNA的1/5距离，随即停止，由另一复制叉走完其余的4/5距离。线粒体DNA复制时，两条链复制是不对称的，先复制一条链，待第一条链复制60%以后才开始第二条链的复制。

环状DNA的复制方式有θ型,滚环型和D环型.不同生物的DNA复制有不同的复制特点.如E.coliDNA的复制为θ型;如质粒DNA的复制为滚环型，许多病毒DNA的复制也是滚环型;如线粒体DNA的复制的特点是D环型。

4.DNA复制的过程

DNA复制的过程包括复制的起始，（此时有由引物酶催化，合成RNA引物。）复制叉的延伸和复制叉的终止三个过程。

二.参与DNA复制的有关物质

（一）.DNA聚合酶1．大肠杆菌DNA聚合酶

2.真核生物的DNA聚合酶

真核生物中也具有三种DNA聚合酶即：α,β,γ。但这些聚合酶都没有3’—5’外切酶活性，其聚合反应机制与原核生物聚合酶一样。主要的酶（占总量的80—90%）是DNA聚合酶α，分子量为300KD，含有4个或5个亚基，主要负责染色体DNA的复制。DNA聚合酶β，分子量为45KD，仅含有一条链，主要作用是修复核内DNA，第三种聚合酶是DNA聚合酶γ，分子量为140KD，存在于线粒体内，负责线粒体DNA的复制。最近从兔的骨髓细胞质中分离到一种新的DNA聚合酶，这种酶与上述真核生物的DNA聚合酶不同，而与原核生物的聚合酶类似，具有3’—5’核酸外切酶活性，称为DNA聚合酶δ。

另外，从酵母，原虫等低等真核生物中分离到一些DNA聚合酶。一般说来，这些低等生物都没有低分子量的DNA聚合酶β，而且与原核生物的DNA聚合酶相似，有3’—5’外切酶活性。

（二）.螺旋酶

DNA复制涉及到的第一问题就是DNA两条链要在复制叉的位置解开，DNA双螺旋并不会自动打开。细胞内的一类特殊的蛋白质称为螺旋酶可以促使DNA在复制叉处打开双链。螺旋酶可以和单链DNA结合，并且与ATP结合，利用ATP分解成ADP时产生的能量沿DNA链向前运动促使DNA双链打开。目前，大肠杆菌中发现有两种螺旋酶参与这个过程，一种称为螺旋酶II或螺旋酶III，与滞后链的模板DNA结合，沿5’—3’方向运动。第二种称为Rep蛋白(α螺旋酶)和前导链的模板DNA结合沿3’—5’方向运动。

(三).单链DNA结合蛋白

螺旋酶沿复制叉方向向前推进产生了一段单链区，但是这种单链DNA不会长久存在，会很快重新配对形成双链DNA或被核酸酶降解。然而，在细胞内有大量单链DNA结合蛋白能很快地和单链DNA结合，防止其重新配对形成双螺旋或被核酸酶降解。SSBP与螺旋酶不一样，它不具备酶的活性，不和ATP结合，大肠杆菌细胞中主要SSBP是177AA肽所组成的四聚体。可以和单链DNA上相邻的32个核苷酸结合。一个SSBP四聚体结合于单链DNA上可以促进其他SSBP四聚体与相邻的单链DNA结合，这个过程为协同结合。

offonoffon3’3’5’5’3’5’SSB螺旋酶II或IIIRep蛋白（α螺旋酶）螺旋酶和单链结合蛋白在复制叉处作用机制（四）.DNA拓朴异构酶

DNA在细胞内往往以超螺旋状态存在，DNA拓朴异构酶催化同一DNA分子不同超螺丝旋状态之间的转变，DNA拓朴异构酶有两种类型，大肠杆菌的ε蛋白就是一种典型的拓朴异构酶I。它的作用是暂时切断一条DNA链，形成酶一DNA共价中间物而使超螺旋DNA松驰化，然后再将切断的单链DNA连接起来。而不需要任何辅助因子。而大肠杆菌中DNA的旋转酶则是典型的拓朴异构酶II，能将负超螺旋引入DNA分子，该酶暂时性切断和重新连接双链DNA，同时需要ATP水解而供能。几乎所有天然状态的双链DNA均以负超螺旋的方式存在，特别是进行半保留复制的DNA均以种种拓朴异构体的形式存在，许多实验证明，负超螺旋是DNA复制的必需条件，因此DNA旋转酶也是复制所必要的，负超螺旋的存在可以使DNA双链碱基对打开所需要的能量降低4.1KJ/mol，因而，有利于DNA的双链分开，许多DNA旋转酶的抑制剂，如萘啶酮酸，香豆霉素和新生霉素等均可以抑制大肠杆菌的DNA复制。

（五）.引物酶和RNA聚合酶

大肠杆菌的引物酶也是DNA复制所必需的一种酶，该酶由一条多肽链组成，Mr为60KD，每个细胞中有50—100个分子，由大肠杆菌的dnaG基因编码，引物酶催化引物RNA分子的合成，但它和传统的RNA聚合酶不一样。对雷米封不敏感，而RNA聚合酶则敏感，引物酶既可以利用NTP，也可以利用dNTP，而RNA聚合酶只能利用NTP，引物酶只能在复制起始点处合成RNA引物而引发DNA的复制，而RNA聚合酶则是启动DNA转录合成RNA从而将遗传信息由DNA传递到RNA，但在单链噬菌体M13DNA和质粒COLE1DNA复制时，引物的合成是由RNA聚合酶催化的。

三..真、原核生物DNA复制特点的比较

1.复制的起始点真核生物DNA的复制是多起始点，原核生物DNA的复制为单起始点。2.复制的方向真核生物DNA的复制是双向复制，而原核生物DNA的复制有些是双向复制，有些是单向复制。3.复制速度真核生物DNA的复制速度比原核生物DNA的复制速度要快得多。真核生物DNA的复制是一次一次地进行，一次复制完成后才进行曲第二次的复制，而原核生物DNA的复制可连续开始复制新的DNA，即在第一次复制完成

之前，可以进行第二次复制。4.复制过程中基因表达原核生物DNA复制过程中，基因不表达即不合成蛋白质。而真核生物在DNA复制过程中，同时有结构基因的表达。如复制过程同步合成组蛋白，最后形成核小体。

四.PCR技术（聚合酶链反应）

（一）.概念

PCR是聚合酶链反应的简称，可以认为是在试管内模拟以及人为的施加一些因素促使DNA片段反复复制而建立起来的一项新技术。在试管内用一对与目的的片段两侧二条链互补的引物在DNA聚合酶的作用下引发某段特异DNA片段进行反复复制的过程，从而使该DNA片段得到迅速增加，便于对该片段进一步分析和研究。

（二）PCR的基本过程

AB为欲扩增的某一DNA片段，首先合成与AB两端互补的寡核苷酸引物（约20个核苷酸）然后将起始反应液中的模板DNA（经加热而变性解链，在降低温度复性时，引物与AB链两端的互补序列退火配对，最后，在DNA聚合酶的催化下进行聚合延伸反应，第一轮反应结束后，AB段DNA相应地加倍，新合成的AB片段本身又为下轮反应的模板，经过变性，退火后，加入新的DNA聚合酶可进行第二轮反应，如此反复进行，DNA片段的数量可呈已的指数增加。

循环解链（热变性）加引物——退火加酶、底物-聚合（三）PCR反应的特点

1.每次循环中以最初原始DNA链为模板的聚合延伸反应所新合成的DNA链长度不确定，与聚合延伸反应时间有关，并且共累积数量与循环次数呈线性关系。2.每次循环中以新合成的DNA链为模板进行的聚合延伸反应产生的DNA片段，其长度固定，等于这对引物之间的距离，并且其累积与循环次数呈指数关系。因此，随着循环次数的增多，这种有固定长度的DNA片段将远远多于没有固定长度的DNA片段。3.按理论计算，一般一个拷贝的DNA模板经过20次循环扩增后，其拷贝数可达220=100万。但是，每次循环中并不是每条DNA链都能起到模板作用而完成DNA合成，因此实际的拷贝数要比理论数低些。一般循环扩增次数为25—30次。4.PCR扩增产物的积累也不是一个无限的指数增加过程，当积累的模板一引物复合物超过在限定时间内聚合酶的聚合能力时，扩增效率便开始下降，当积累太多的模板DNA片段时，它们在变性后又可以自身退火而不与引物退火，于是扩增效率也开始下降。这样就到达所谓的高占期，并出现许多小片段。5.PCR方法最早用DNA聚合酶的大片段（Klenow片段—polI用枯草杆菌蛋白酶水解后得76KD和34KD两个片段，76KD为大片段）来进行DNA的延伸，以达到扩增微量目的基因的目的，但是每次循环加热变性时都导致Klenow片段的失活，需要重新加酶，增加了PCR的费用，操作也复杂，而且合成的片段不均匀，出现一些无关的片段，原因是Klenow片段在370C下催化DNA链聚合延伸时，由于温度较低，引物引发的DNA聚合特异性较差。另外Klenow片段聚合延伸DNA时错配的频率较高，约10-4—10-6碱基。为了克服这些不足，人们改用T4DNA聚合酶进行PCR，发现扩增后的DNA片段很均一，而且片段的真实性较高。但T4DNA聚合酶仍不耐热。每次循环仍需加入新酶，从耐热菌中纯化到一种TaqDNA聚合酶，可以在较高温度下（700C—750C）进行聚合催化，并且可以耐受950C高温，因此，不需每次循环加入新酶，而且在较高温度下聚合延伸DNA链，大提高了扩增DNA片段的特异性，产量及所扩增片段的长度，从而使PCR技术达到较为成熟的阶段。

（四）PCR技术的应用

PCR技术在分子生物学领域和临床实践中应用越来越广。1.应用到遗传病诊断和产前诊断。2.肿瘤致癌基因的检测。3.各种感染性疾病病原体的鉴定。4.DNA片段的直接测序。5.cDNA文库的建立。6.特定基因的筛选。7.用PCR技术进行定点突变等。

PCR技术已经成为分子生物学中的一个有力的实验手段。

第二节RNA的合成

RNA的生物合成也有两种方式，一种是以DNA为模板指导的RNA的合成称为转录，另一种是以RNA为模板指导的RNA的合成称为RNA的复制。

一.RNA聚合酶

细菌的RNA聚合酶，像DNA聚合酶一样，具有很复杂的结构，其活性形式（全酶）为15S，由5种不同的多肽链构成一即5种亚基组成，按分子量大小排列分别为（155KD）（151KD）（70KD）（36.5KD）和（11KD）。其中亚基在RNA聚合酶分子中有两个，其余均只有一个。故全酶为α2ββ’ωσ（450KD）。其中α2ββ’称为核心酶。

（一）原核生物RNA聚合酶

E.coliRNA聚合酶的亚基的性质及功能

亚基名称

基因名称分子量

全酶中的数目

功能αrpoA36．5KD2与σ结合，酶滑动及碱基识别有关βrpoB151KD1聚合作用酶与底物结合β’rpoC155KD1与DNA结合ω11KD1不详σ

rpoD70KD1识别启动子起始转录（起始因子）ρrho46KD6终止转录（终止因子）nusAnusA69KD1（转录延长）抗终止

σ亚基和其它肽链的结合不很牢固，核心酶具有催化作用，σ亚基在只与转录的起始有关。β亚基是酶和核苷酸底物的结合部位，它对利福平敏感。β’亚基而碱性较强，适合于与模板DNA相结合，σ亚基在可能是识别其相应的启动子。细菌的RNA聚合酶分子大，结构也复杂，但某些噬菌体特有的RNA聚合酶则要小得多。如T3和T7噬菌体RNA聚合酶，仅由一条多肽链组成，分子量只有11KD，且能很快合成RNA，其速率在37度时可达200核苷酸/秒。这时因为噬菌体RNA合成所需的机构可以远比宿主的酶小，转录仅需一个“最小”的机构，这种酶只能识别噬菌体本身所有的少数几个启动子，它们不能识别其它启动子。相比之下，宿主细菌的RNA聚合酶都能转录细胞内的许多转录单位（大于1000个）中的任意一个。

（二）真核生物RNA聚合酶

原核生物的RNA聚合酶在每种生物中只有一种类型，各种RNA的合成均由它催化。而真核生物则有多种形式的RNA聚合酶，对不同形式的RNA聚合酶，其结构，功能，在细胞内的分布，模板的特异性等均不尽相同。一般根据对特异性抑制剂鹅膏蕈碱的敏感性和亚基的组成可分为酶1、2和3。它们的分布功能等如下表表示：

名称

别名

细胞分布

功能

鹅膏蕈碱抑制程度（A）rRNA核仁

rRNA合成

>10-3（不敏感）聚合酶（B）不均RNA核质

hnRNA10-9-10-10（高度敏感）聚合酶（C）小分子RNA核质5SRNA、tRNA10-4-10-5

（中度敏感）聚合酶真核生物RNA聚合酶的亚基组成相当复杂，亚基种类有4—6种，数目4—10个不等。其中有两个大亚基（一般说一个约200KD，另一个约140KD）还有10个以下的小亚基（每个分子量约为10—90KD）。但分子量相差不大，都在500KD左右，都会Zn2+。线粒体和叶绿体中的RNA聚合酶比胞核中的RNA聚合酶要小得多，并且与核中的酶完全不同。这些酶类似于噬菌体的RNA聚合酶。

二.真原核生物基因结构的某些特点的比较

（一）启动子

启动子又称为启动基因，是DNA分子上可以与RNA聚合酶特异结合的部位，也是转录开始的部位。

1.启动子一般可分为两类

一类是RNA聚合酶可以直接识别的启动子，这类启动子应当总是能被转录，但实际上也不都是如此，外来蛋白属于对其有影响，即该蛋白质可直接阻断启动子，也可间接作用邻近的DNA结构，使聚合酶不能和启动子结合。另一类启动子在和聚合酶结合时需要有蛋白质辅助因子的存在，这种蛋白质因子能够识别与该启动子顺序相邻或甚至重叠的DNA顺序。

2..原核生物的启动子

原核生物的启动子长约40—60bp，至少包括三个功能部位。一是启动子的起始部位，这个部位是与转录合成的RNA链中第一个核苷酸互补的碱基对。二是启动子的结合部位，这是RNA聚合酶与启动子牢固结合的位点，位于—10BP处，该部位富含AT碱基对，具有很强的同源性，其顺序为TATAATG，故称为TATA盒(TATAbox)，又称pribnow盒。三是启动子的识别部位，这是RNA聚合酶识别DNA所必需的，它位于—35BP处，具有TTGACA顺序或类似的序列，其中TTG顺序高度保守。原核生物中也有少数启动子缺乏—10和—35处这两个序列，此时RNA聚合酶不能单独识别这种启动子，而需有辅助蛋白质的帮助，可能是这些蛋白因子与邻近序列反应可以弥补启动子的这种缺陷。

3.真核生物的启动子

在真核生物中的启动子与原核生物启动子不完全相同.真核生物启动子也有一特殊的富含A—T碱基对的区域，比序列位于—25bp处，也称TATA盒，又称为Goldberg-Hognessbox，是RNA聚合酶II的结合部位。在转录起始点上游70—80bp处,有CAAT顺序也称CAAT盒，这一顺序也是比较保守的共同顺序：GCCTCAATCT。RNA聚合酶可以识别这一顺序。其作用尚不十分清楚，但近年来在对家兔B珠蛋白基因CAAT顺序的研究中发现，用人工方法诱导CAAT顺序发生突变可以使家兔β珠蛋白基因的转录水平降低。

4.RNA聚合酶与启动子的结合大肠杆菌的RNA聚合酶与启动子结合过程可分为两步：酶找到启动子顺序并与其以“关闭”复合体的形式（即双螺旋形式）相结合，原核生物这一步所识别的是—35序列，真核生物这一步所识别的是–70—-80序列，这一序列的突变可损害启动子的结合。

“关闭”复合体转变为开放复合体（即双螺旋被解旋，两条链分开），此时酶的结合比较紧密。在这个转变中—10或-25区约有17bp被解旋，暴露出模板链。—10序列富于AT碱基对，因为AT对比GC对更易于“融化”，—10区的突变可阻碍开放复合体形成。

5.不同启动子需要不同因子

E.coli细胞中主要的σ因子可与核心酶一同被纯化，称为σ70。但细菌细胞中另外有一些σ因子能够识别其顺序与E.coli的主要启动子不同的另一些启动子，并促使核心酶起始转录。这些变异的σ因子在细胞中有特别功能，通常能剧烈改变细胞RNA的合成方式，以便在需要时使一组全新的基因得以表达。这是在枯草杆菌中首次发现的。它的作用是开启在芽胞形成

过程中需要的一套新的蛋白质的表达。噬菌体往往有其自己的σ因子，借以在噬菌体发育的某一特殊阶段开动其所需要的某些噬菌体基因的转录。在E.coli中共有17个热休克基因，其表达有赖于正常转录的改变。基因htpR是其主要调节器，htpR的产物是一个32KD的蛋白质，它就是一种变异的σ因子，称为σ32。而将正常的σ因子称为σ70（表示分子量为70KD）。然而σ32很不稳定，故调控它的表达状况就可以使其量迅速增多或减少。σ32能引导核心酶在热休克基因的启动子处起始转录。这些启动子的顺序与正常的共同顺序是不同的，特别是其—10顺序几乎完全不同（如下表）

E.coli的不同σ因子识别不同的共同顺序

因子

基因

功用

—35顺序

间隔距离

—10顺序

σ70rpoD正常状态

TTGACA16—18bpTATAATσ32rpoH热休克

CNCTTGAA13—15bpCCCCATNTσ60rpoN氮的利用

CTGGNA6bpTTGCAE.coliσ60是氮饥饿时起作用，正常时，E.coli细胞中仅有少量σ60，但当分质中氨缺乏时，σ60却大量增多，以开启某些利用其他氮源的基因。这就是说，σ60能引导核心酶识别启动子的另一种共同顺序。σ60所识别的—35顺序实际上位于—20处，因为-10和两侧顺序之间距特别短，只有6bp。

6.调节蛋白与启动子的结合

启动子的效率高低不一，实验显示，与聚合酶结合和开放复合体形成这两个步骤的效率在不同的启动子中是不同的，因此，细胞内不同启动子的效率可有几个数量级的差别，从每10分钟以上方有一次转录起始到每1—2秒起始。但是即使是同一基因，其转录效率也不是固定不变的。在不同的生长情况下转录可根据需要而改变。在E中转录的调节常常是通过某些蛋白质的介导。这种调节蛋白能够在启动子处或靠近启动子处与DNA分子相结合，从而增高或降低RNA聚合酶起始RNA合成的效率。这些蛋白质能与RNA聚合酶结合并提高其活性，称为激活蛋白。有些则能阻断RNA聚合酶的结合，从而抑制转录，称为阻遏蛋白。凡需要激活蛋白才能充分发挥作用的启动子常常与—35共同顺序很不相似，这提示激活蛋白可以取代这个结合位点，作为一种启动子的阻遏蛋白可能是另一种启动子的激活蛋白，反之亦然，这取决于其结合位点的准确位置。

(二).断裂基因

断裂基因是原核生物和真核生物基因结构的主要区别之一。细菌DNA一级结构和蛋白质一级结构直接互相对应，即遵循共线性原则。而真核基因则由编码顺序和不编码顺序相间排列，同属一个转录单位。非编码部分则只出现mRNA前体中（即hnRNA中），不出现于成熟的mRNA对于一定长度的DNA来说，其内含子数目和长度无一定规律。一般来说，内含子比外显子长。

1..内含子的种类

（1）.细胞核mRNA前体中的内含子。（2）.由RNA催化的拼接反应切除的内含子。（3）.酵母线粒体II类内含子。（4）.tRNA基因内含子。

2.内含子的功能

目前认为内含子的功能可能有如下方面：

（1）.内含子增加基因长度，使易于发生基因重排，从而增加了进化过程的适应性。（2）.内含子可能参与调控自身转录产物的拼接。（3）.外显子与内含子的交界处，可能反映了由加工后基因顺序所编码的蛋白质中的功能区域。（4）.能够编码蛋白质。（三）.转录单位与转录子

1.

转录单位

转录单位是指RNA聚合酶作用的起始点与终止点之间DNA顺序。原核生物和真核生物均有转录单位。如原核生物的基因表达就是以操纵子作为转录单位。真核生物中28S、18S、5.8SrRNA的基因处在一个转录单位中。

2.转录子

转录子是指2个以上紧密连续的并共同转录在一种mRNA分子中的结构基因组成的复合单位。它相当于一个操纵子的结构基因区，转录产物是多顺反子mRNA。真核生物mRNA均为单一结构基因的转录产物，故无转录子可言。

3.转录因子

nusA蛋白多年来被忽视，这是因为RNA聚合酶的基本活性并不需要nusA，同时nusA也不和RNA酶一起被纯化。入噬菌体的N基因编码的蛋白是一种调节因子，它的功能是在入噬菌体生长时防止转录的终止（抗终止作用）。而nusA蛋白能和N基因编码的蛋白紧密结合，这表示nusA在RNA合成中有重要作用。nusA与RNA聚合酶核心酶相结合，这类似σ因子，但不太紧密，故在纯化时往往σ因子取代了nusA。在细胞内则当σ因子从RNA聚合酶内释出时，nusA才能与核心酶结合，然而在RNA链延伸时，nusA亦不固定地和一个RNA分子相结合。因为已发现在转录时一个nusA分子里与好几个RNA聚合酶分子相作用。所以，即使活细胞内nusA分子不多（估计每个细胞只有数百个），仍然是够用的很可能当RNA聚合酶从DNA上释出后，σ因子又马上取代了nusA蛋白，在转录过程中，nusA究竟有什么功能还不了解，但实验证明它是不可缺少的蛋白质。真核生物在转录时往往需要多种蛋白质因子的协助。一种蛋白质是不是转录机构的一部分往往是通过体外系统看它是否时转录起始所必须的。一般可将这些转录所需的蛋白质分为三大类：（1）RNA聚合酶的亚基，它们是转录必须的，但并不对某一启动子有特异性。（2）某些转录因子能与RNA聚合酶结合，形成起始复合物，但不组成游离聚合酶的成分，这些因子可能是所有启动子起始转录所必须的。（3）某些转录因子仅与其靶启动子中的特异顺序结合与RNA聚合酶II的启动子中某些特异顺序相结合的转录因子（四）.转录终止信号

细菌DNA中有转录终止信号，称为终止子，终止子的作用是在DNA模板的特异位点处终止RNA的合成。在终止处，RNA聚合酶停止其聚合作用，将新生RNA链释出，并离开模板DNA。原核生物的转录终止信号可以分为两类:1.一类是弱终止信号，由ρ因子与RNA聚合酶结合，阻止RNA聚合酶越过终止信号而使转录终止。2.另一类是不依赖于ρ因子的强终止信号。不依赖于ρ因子的终止子有两个特征：(1)DNA顺序有双重对称，位于RNA3’—端前15—20核苷酸处。(2)DNA模板链中有一串约6个A，转录为RNA3’—端的U双重对称的意义在于其转录体能形成发夹结构。

模板DNA：5’CCCAGCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTT3’3’GGGTCGGGCGGATTACTCGCCCGAAAAAAA5’转录本RNA：5’CCCAGCCCGCCUAAUGAGCGGGCUUUUUUU3’AAU5’CCCA—UUUUUUU3’C—GG—CC—GC—CC—GG—CCUGA发夹结构为什么这两个结构能引起终止呢？其解释是发夹的茎的前半过早地和RNA—DNA杂交双链中的后串部分退火，仅剩下多聚U序列和模板链杂交，因为这样一个由几个U和几个dA形成的RNA—DNA杂交双链是很不稳定的，于是新生的RNA链将很快自DNA双链中被排除出来。

ρ因子的作用机制：ρ因子在RNA的存在下能水解ATP，说明它能与新生RNA链结合，并可能应用ATP放出的能量将RNA链从酶和模板中释出。ρ因子可能与RNA聚合酶结合，编码ρ因子的基因rho发生突变时产生的某些ρ蛋白仅能在RNA聚合酶的B亚基也发生相应突变才能有终止RNA合成的活性。已知RNA聚合酶本身能识别DNA模板中依赖ρ的终止顺序，而ρ因子是在以后才发挥作用而释出RNA的。证据是在没有ρ时，RNA聚合酶也在依赖ρ的终止子处暂停，不过以后仍继续向前进。故有人认为，即使有一个很弱的发夹也可能使RNA聚合酶停止前进，此时ρ因子即可与之结合而将聚合酶和RNA解离下来。所以ρ也是一种酶。三.真核生物与原核生物RNA转录的比较真核生物与原核生物RNA的合成基本类似，除RNA聚合酶，断裂基因等不同外，还有两个重要的区别：原核生物中转录和翻译同时进行，因原核生物无细胞核，所以一旦合成了小段MRNA，核蛋白体就可与之结合起始翻译。而真核生物的转录与翻译在细胞的不同部位进行，首先在细胞核中合成mRNA前体，并与蛋白质结合生成核蛋白颗粒，再经修饰加工成为成熟的mRNA，进入胞浆才能与核糖体结合起始翻译。真核生物中，DNA与组蛋白结合在一起，形成染色质，一般认为非组蛋白能通过影响DNA结构或DNA分子没部位的活性使具有转录活性的区域部分暴露，以指导RNA聚合酶起始特定的转录。四.RNA转录后的加工修饰

（一）.噬菌体T7的早期mRNAs

细菌的mRNA不需经过加工，但噬菌体T7的早期基因例外。这些基因被转录成为一个多顺反子mRNA，然后被切割为单顺反子mRNA。其过程如下：

A1A2A30.30.71.111.31.2终止pppPuC-OHpppPuUOHPGPGPAPGPCUOHUOHUOHUOHUOH前导区0.3mRNA0.7mRNA1.1mRNA1.2mRNA1.3mRNARNaseIII转录起始启动子基因T7噬菌体的早期区被转录为一条RNA链，然后再被RNA酶3切割为五个mRNA分子：由图可见，开始时产生一条RNA，约有7000bp长，包括6个基因。RNA酶3能将此转录本切割为4个单顺反子和一个双顺反子mRNA。T7被切割的位点在发夹式的结构上，但在茎上会有一个不配对的“泡”，RNA酶III的切割点即在此“泡”中或其附近。

RNaseIII5’3’0.3mRNA0.7mRNA泡（二）.snRNAs的作用

真核细胞的细胞核和细胞浆中都含有许多小RNA。它们是由RNA聚合酶II或III所合成的，其中某些像mRNA一样可被加帽。在细胞核中的小RNA称为snRNA，而在细胞浆中称为scRNA。天然状态下它们均与蛋白质相结合，故分别称为snRNP和scRNP。某些snRNAs和剪接作用有密切关系。有些snRNPs分别和供体和受体剪接位点以及分支顺序相互补。snRNAs中最受注意的一个是U1，它普遍存在于哺乳动物，鸟类和昆虫细胞中，人U1snRNP中除RNA外还有8个蛋白质分子。一般认为，脊椎动物细胞有6种不同的snRNAS称为U1—U6，最小的U6有约100核苷酸长，最大的是U3，也不过215核苷酸长，它们和蛋白质结合成snRNPs。

（三）.核内不均一RNA（hnRNA）

编码蛋白质的结构基因是在核浆中被转录的，但是核浆中的RNA却并不像mRNA。核浆RNA要大得多，很不稳定，并且其顺序的复杂性也要大得多。由于它的大小很不一致，故称为核内不均一RNA。实验证明，mRNA确定是从hnRNA生成的。细胞浆内的mRNA平均只有1800—2000个碱基。而哺乳动物的hnRNA平均有8000—10000碱基，其范围很广泛，从2000—14000碱基均有，所以一般要比mRNA大4—5倍。如果以5倍计算，由于正常哺乳动物细胞中测得mRNA仅占hnRNA量的5%，则相当于有25%的hnRNA可转变为mRNA。这意味着有3/4的hnRNA即在核内降解。hnRNA被切除内含子后即成为mRNA，并进入细胞浆内。但在切除内含子之前，hnRNA可先加帽和加polyA尾。有一种称为PolyA聚合酶的酶可以用ATP为底物。以加上PolyA尾，这是hnRNA转变为成熟的mRNA所必须的。可能多聚腺苷酸化是hnRNA分子要被加工的信号。hnRNA的尾端要被切去一段，然后才加上polyA。因为RNA聚合酶在转录时即已通过了相当于加上polyA的位点，故hnRNA尾端的多余部分要由内切核酸酶切去，才能加上polyA。

（四）.rRNAS的加工

真核生物rRNA的成熟过程现在已经搞得比较清楚了。哺乳动物的初级转录本是一条45SRNA链，含有18S、5.8S和28SrRNA。它含有约110个甲基（碱基甲基化），这是在转录过程在或刚刚转录好时加上去的。几乎所有甲基均连接在核糖残基上，在被加工成熟的rRNAS中，这些甲基全部被保存。在成熟的18SrRNA上有约39个原来的甲基，只有4个是后来在细胞浆中加上去的，而在28SrRNA中约74个甲基，全部是原来的，有人认为甲基的存在是初级转录本转变成熟的rRNA的标志。成熟的途径可能不止一条，因为中间的长度在不同途径中是不一样的，然而最终产物都是一样的，现将其中两条途径（Hela途径和L途径）

1.真核生物rRNA的成熟哺乳动物的45S前体在每个间隔区中被切割而成为成熟的rRNAS18s5.8s28s5’3’前体P4518s5.8s28s5’3’18s5.8s28s3’18sP45P41P205.8s28s3’18sP325.8s28sHela途径5.8s28sL途径18s5.8s28s5’3’18s5.8s28s3’18sP45P415.8s28s3’P365.8s28s3’P32由图可见，切割的位置是18S基因的5’侧，18S和5.8S基因之间的间隔区和5.8和28S序列之间的间隔区（5.8S序列成为一个和28SRNA通过碱基配对相结合的小RNA）。

细菌的rRNAS也是通过切割其共同前体形成的。E.coli的七个编码rRNA的操纵子称为rrnA—G。它们在染色体上并不相连锁，每个操纵子均转录为一个RNA前体。然后被切割为成熟的rRNA分子。这些rRNA操纵子的组成基本相同，均含有顺序为16S—23S—5S的三个rRNA分子。

2.原核生物rRNA的成熟DNAP1P216St1t25S23StRNAtRNA16S5S23StRNAtRNA16StRNA5S23StRNAP30RNaseIII转录

两个主要的rRNA（16S和23S）之外，还有一个5SrRNA存在于同一转录本中，所有rrn操纵子均有双重启动子（P1P2）结构，第一个启动子位于16SrRNA序列的起始点的上游约300bp处，P1可能是主要的启动子。在P1的右方约110bp处是第二个启动子（P2）。在16S和23SrRNA之间的序列是一个400—500bp的转录间隔区，在此区内有编码tRNA的序列。在4个rrn操纵子中，此转录间隔只含一个tRNA序列，即tRNAGlu，而在另外三个rrn操纵子中此间隔区含有两个tRNA序列，即tRNAIle和tRNAAla，不同rrn操纵子之间的另一个差别是，有的操纵子的前体RNA的末端序列编码5SrRNA，而另一些操纵子则还要编码tRNA。加工rRNA的酶是RNaseIII。16S和23SrRNAS的前体分别称为P16和P23，它们分别比16S和23S略长些，在初级转录本中，由于P16和P23的两端的碱基都是互补的，它们分别形成很大的发夹。其特征是发夹环非常大，分别约为1600个核苷酸（P16）和2900个核苷酸（P23）。

（五）.tRNA的加工

tRNA基因往往成簇存在，不论在原核生物或真核生物中均如此。在E.coli中至少某些tRNAS能聚在一起，形成操纵子，并由一个启动子转录成一条长的前体RNA链，例如，T4噬菌体即有由8个tRNA基因所组成的簇。虽然情况各有不同，但有一条共同规则：每个tRNA均是一个长的前体RNA的一部分。E,coli中已找到两个tRNA基因簇，二者均除tRNA基因外尚含有其他基因。在每个tRNA基因簇中，唯一的启动子常位于第一个tRNA基因之前，在最后一个tRNA基因的后面还有编码蛋白质的基因。E.coli中还有一种RNA酶P，它是一种内切核酸酶，负责切割所有tRNA分子的5’—端，不论是在其与5’前导序列的接头处，还是在顺反子之间的序列处，RNA酶P是一种不寻常的酶。它由蛋白质和RNA二者组成，分子中RNA有375个碱基长（约130KD），而蛋白质组分要小得多。大约只有20KD。在E..coli中基因rnpA编码其蛋白质组成，而rnpB编码RNA部分。这两个基因相隔甚远，RNA和蛋白质这两个组分对RNA酶P的催化活性似乎都是必须的。还有一个酶叫做RNA酶D，它能从RNA的3’端一个一个地切去碱基，以产生tRNA的真正的3’一端（5’一端由RNaseP产生）。另一个也带有外切酶活性的酶是RNaseII，它能够将tRNA完全分解（此酶与tRNA加工无关，只与RNA的分解有关）。在细菌中有两种tRNA前体，其区别在于其3’端的序列，1型分子有CCA三联体在其3’端。但某些噬菌体编码的2型分子则没有CCA序列。当其他碱基被一个一个从前体分子上除去后，另由称为tRNA核苷酰转移酶将CCA加到3’端上去。目前认为真核生物中可能所有的tRNA前体都属于2型，在成熟时都需要通过酶作用，在其3’端加上CCA序列。

五.RNA的剪接机制

（一）酵母tRNA的剪接

RNA的剪接就是要把断裂基因的转录本中的内含子除去。酵母细胞核中400个tRNA基因中约有40个是断裂基因。这些基因均只有一个内含子，位于与反密码子的3，侧相隔一个核苷酸之处，长度14—46bp。不同氨基酸的tRNA基因中的内含子不相同，但所有内含子中均有一段与tRNA的反密码子互补的序列，因而使反密码臂的构象发生了改变。即反密码子被配对而使反密码臂伸长了很多。但在前体中tRNA的其他部分仍保持正常结构。此剪切过程分为两个阶段：第一步是磷酸二酯键的断裂。这一步由一种核酸内切酶所催化。第二步是连接反应，需要ATP的存在，由RNA连接酶所催化。（需要ATP）。酵母tRNA前体也可以在瓜蟾的卵母细胞核提取液中正确地被剪接，这表示此剪接反应没有种属特异性。

5’POH3’5’POH3’OHPOH3’5’P5’POH3’OHP核酸酶两个半分子内含子连接酶（二）自身剪接反应

以前一直认为只有蛋白质有酶活性，然而近年发现了RNA也有酶活性，这种有酶活性的RNA有人称为ribozyme。一种四膜虫的两个主要rRNA基因被转录在同一个初级转录本中，此转录本称为35S前体RNA，较小的rRNA的序列在5’侧，较大的rRNA（26S）序列在3’侧。在编码26SRNA序列中存在一个单一的短的（约400bp）的内含子。将这个35S前体RNA在体外温育，可以发生自动剪接作用。其过程如下：第一次转移：GMP的3’OH攻击内含子的5，端。第二次转移：外显子A的3’—OH攻击外显子B的5’—端。第三次转移：内含子的3’OH攻击距5，端15个碱基处的键，内含子成环。此反应无须ATP或GTP供能，不需要蛋白质的存在，这种反应基本上是一种磷酸酯转移反应。RNA有能力自行剪接，故称为自身催化作用。某些线粒体中的内含子也是自身剪接的内含子，一些常见的真菌，酒酵母等的线粒体内含子都能进行自身剪接。T.Cech和S.Altman各自独立地发现RNA具有催化作用，从而改变了生物催化剂的传统概念，为此分们共同获得了1989年NObel化学奖。

（三）能够编码蛋白质的内含子

某些真菌线粒体中的内含子有很不寻常的结构：这些内含子中含有编码顺序，这些顺序的翻译对于该顺序所在的内含子的剪接是必须的。线粒体中的60基因是编码细胞色素b的，box基因中的外显子1有417bp，编码Cytb的N端139个密码子。内含子1有765bp，不编码，外显子2非常短，仅有5个密码子。其后是一个很长的内含子2。内含子2的特点是其开头840bp是一个开放阅读框，有280个密码子，其最后一个密码子为终止密码子。当将内含子1剪去后，翻译即从外显子1起始，通过外显子2而进入内含子2的ORF，产生一个有423个氨基酸残基的蛋白质（其中144个是Cytb的N端氨基酸，279个则由内含子2编码）称为RNA成熟酶。RNA成熟酶是特异性剪去内含子2的，这样，这个酶促反应便成为一个非常敏感的负反馈途径。去除内含子2后，外显子1和2即外显子3相连接，因而破坏了编码成熟酶的顺序。

417内含子1内含子2外显子1外显子2外显子314765840（ORF）1240100外显子1内含子1内含子2外显子3外2外2外显子1内含子2外显子3ORF编码成熟酶外显子1外2外显子3成熟酶转录核酸酶切除内含子1翻译成熟酶切除内含子2成熟的CytbmRNA（四）套索的产生

Hela细胞的核提取液能够剪接纯化的RNA前体，这表示剪接作用并不与转录作用相关连。RNA的修饰也和剪接无关。核内剪接需要ATP，与自身剪接不同，此剪接过程也可分为两个阶段。在第一阶段中，内含子左端（供体位点）处被切断，形成两个分离的RNA分子，即左外显子和右内含子—外显子。左外显子为线性分子，而右内含子—外显子则不然，内含子左端（5’端）以5’—2’键在内含子右端上游约30碱基处的CTGAC序列（共同序列）中的A相连接，于是形成一个“套索”。在第二阶段，在受体位点处被切断而将此套索状的内含一阵子剪去，同时分离的右外显子即与左外显子连接。套索然后被“脱支”而形成线性内含子。

前体5’3’3’2’5’3’5’3’3’5’内含子套索结构脱支外显子13’5’外显子1外显子2外显子2外显子25’3’外显子1外显子2内含子5’2’连接内含子5’端形成套索供体位点受体位点（五）细胞核中的剪接连接点

剪接连接点是指切断和重接位点处的两旁的顺序。在内含子左侧的称为受体。在细胞核的结构基因（即编码多肽的基因）中的所有内含子在外显子——内含子连接点处均有GT•••••••AG的共同顺序。外显子•••••AGGTAAGT•••••内含子•••••Py10CAG

•••••外显子供体位点受体位点这些还是较短的共同顺序存在于几乎所有的真核生物。

六．反义RNA

反义RNA是指与mRNA互补的RNA分子。这种反义RNA能与mRNA分子特异性地互补结合，从而抑制该mRNA的转录加工与翻译，是原核细胞中基因表达的调控的一种方式，然而，多实验证明，在真核生物细胞中亦存在反义RNA。（一）原核细胞内天然存在的反义RNA

1类：这类反义RNA直接作用于其靶mRNA的SD序列和线编码区，引起翻译的直接抑制（1A类）或与靶mRNA结合后引起该双链RNA分子对RNA酶3的敏感性增加，使其降解。注：SD顺序：SH（人名）顺序的简称，是mRNA起始部位的碱基顺序，为mRNA与核糖体的结合位点。（DNA上相对应的位点也称SD顺序）2类：这类反义RNA与mRNA的SD序列的上游非编码区结合，从而抑制靶mRNA的翻译功能。其作用机制不完全清楚。可能是反义RNA与靶mRNA的上游序列结合后会引起核糖体结合位点区域的二级结构发生改变，因而阻止了核糖体的结合。3类：这类反义RNA可直接抑制靶mRNA的转录。

（二）反义RNA的功能1.调控细菌基因的表达例如micFRNA对ompF基因表达的调控。ompF蛋白是E.coli的外膜蛋白的主要成分之一，micF-RNA是从另一基因（ompC基因）附近的DNA序列转录而来的，和ompF-mRNA的5’端有70%的序列互补，因此在体外micF-RNA可以抑制OmpF-mRNA的翻译。2.噬菌体溶菌溶原状态的控制反义RNA也参与了入和P22噬菌体的溶菌/溶源状态的控制。P22噬菌体编码一种抗阻遏蛋白Ant，它可以抑制许多入样噬菌体阻遏蛋白和DNA的结合。但是Ant必须在严格的控制下，否则Ant的过分表达必将阻止溶源状态的建立，而成为溶菌性的噬菌体。Ant蛋白表达的控制是利用反义RNA能与antmRNA的翻译起始区互补结合，从而控制antmRNA翻译成Ant蛋白。3.IS10转位作用的抑制outRNA是一种反义RNA，可以和IS10编码的转位酶mRNA（INRNA）5’端结合而抑制其翻译。当细胞内只有一个拷贝IS10时，只能生成很少量的RNA，故转位酶仍可生成。但当IS10的拷贝数增多时，outRNA愈来愈多，其控制作用亦明显增强，所以称为多拷贝抑制现象。这种现象可防止IS10的过量堆积而引起的细胞损害。

（三）人工合成构建反义RNA

既然反义RNA在原核生物中对基因表达起着重要的调控作用，那未人工设计在天然状态下不存在的反义RNA来调节靶基因的表达，想必也是可能的。在人工合成的反义RNA中，由于目前对靶mRNA的SD序列的上游区的结构了解甚少，因此设计出1类反义RNA以期达到调节该mRNA翻译的目的是比较困难的。但只要靶基因的核苷酸顺序知道，就可以人工设计出1类反义RNA。同时只要在靶mRNA上找到一段连续的U序列，就可以设计出3类反义RNA，有时还可以设计同时具有1类和3类反义RNA功能的反义RNA。

（四）设计反义RNA基因时应注意如下几点

1.长的反义RNA并不一定比短的反义RNA更为有效。2.在原核生物中针对SD序列及其附近区域的反义RNA可能更有效。3.在真核生物中，对应于5’端非编码区的反义RNA可能比针对编码区的反义RNA更有效。4.尽量避免在反义DNA分子中出现自我互补的二级结构。5.设计出的反义RNA分子中不应有AUG或开放阅读框。6.进一步还可以将带有ribozyme结构的RNA连在反义RNA的3’端尾上，当反义RNA与靶mRNA杂交后，即可利用其酶活性来降解靶mRNA。此外，为了增强反义RNA的作用，还可以采取一些额外措施。如，由于反义RNA对靶mRNA的抑制作用有剂量依赖性，所以在构建反义RNA基因时，要选择强的，可以诱导的启动子以增强反义RNA本身的表达。也可以构建许多个反义RNA基因串连在一起，以得到线性重复的多拷贝基因，对提高反义RNA的表达也有利。

第三节：蛋白质的生物合成

一.概述

通常将mRNA中蕴藏的遗传信息的碱基顺序称为遗传密码。

(一)遗传密码具有如下特点

1.遗传密码是三联体。2.密码子之间无标点符号。3.密码子有方向性。4.密码子有简并性。5.密码子中有一组起始密码子和三组无意义密码子。6.密码子在生物界是通用的。

在形成肽键之前，氨基酸必须先与tRNA结合形成氨酰tRNA。催化tRNA与氨基酸结合的是氨基酰tRNA合成酶，此酶有高度特异性，每种氨基酸都有自己的tRNA，各种tRNA3’端均为CCA—OH，氨基酸与3’—OH结合形成氨酰—tRNA，tRNA反密码环顶端上有三个连续的核苷酸，称为反密码子。能与mRNA中的密码子配对，这样某一氨基酸与其特异的tRNA结合后，就可以按一定的顺序排列到mRNA分子上。

（二）蛋白质的生物合成阶段

蛋白质的生物合成大体上可分为如下几个阶段：氨酰—tRNA的合成。70S起始复合物的形成（真核生物为80S起始复合物的形成）。肽链的延长。终止阶段。参与起始过程的tRNA是蛋氨酰tRNA（原核生物为甲酰蛋氨酰—tRNA）。与在肽链延伸过种中携带蛋氨酸的tRNA具有相同的反密码子。但是两种蛋氨酰tRNA的结构又有所不同，因此只有前者才能与起始因子相作用而参与起始过程，这种tRNA称为起始tRNA。符号为Met—tRNAf或Met—tRNAi（原核生物起始tRNA为fmet-tRNAf）。

二.遗传学的第二套密码系统

（一）第二套密码系统的实验证据

—tRNA分子上某些（个）碱基对能决定tRNA的特异性

早在70年代初，一些实验室就观察到酪氨酸tRNA琥珀抑制子大氨基酸接受柄上的突变能使tRNA错误地携带谷氨酸。同样，CUA琥珀抑制反密码子也能引起其它一些tRNA误被谷氨酰化。1984年，Prather等发现突变的tRNA有仅保留对Lys的特异性，而且也能携带ALA或Gly。更为直接的证据是1990年Normanly等的实验显示，取代亮氨酸tRNA中的12个碱基（无反密子碱基的取代），能够使tRNA-Leu转变为tRNA-Ser。由此可见，反密码子在决定tRNA的特异性方面并非是唯一的关键。

（二）第二套密码系统的概念和特征

Christiam提出了第二套密码系统的概念或学说。该学说认为：tRNA氨基酸接受柄有一辅密码区，可以被氨基酰tRNA合成酶识别，并决定tRNA的特异性。它认为第二套密码系统蕴含于aaRS结构中。他将第二套密码系统的特征描述为；

1.与经典密码系统不同辅密码子密码系统或第二套密码系统是非简并性的，可能只有20种aaRS，每种aaRS能够识别特异于某种氨基酸的所有tRNA