微生物的培养与应用 微生物的实验室培养 课件

微生物的培养与应用课题1

微生物的实验室培养巴斯德（近代微生物学家和奠基人）㈠.微生物的类群微生物原核类:真核类非细胞类：细菌、支原体、放线菌、蓝藻个体微小、结构简单酵母菌、霉菌、食用菌真菌：原生生物：显微藻类、原生生物（如：草履虫、变形虫等）病毒、类病毒、朊病毒◆微生物的共同特点：一.微生物基础知识几种菌落及其形态酵母菌青霉菌——青霉素真菌病毒的结构:由核酸和蛋白质构成SARS病毒、禽流感病毒朊病毒（蛋白质）吸附注入合成释放组装病毒的繁殖病毒的营养方式：寄生1.何为培养基？3.不同的培养基有不同的配方，但是其基本成分都相同，都包括哪些营养成分？有何作用？请举例说明。思考:

2.按照不同的培养基划分标准，培养基有哪些种类、配制特点及其应用？一、培养基一、培养基

人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。1.定义:2.分类:一、培养基按成分划分合成培养基天然培养基半合成培养基按形态划分固体培养基液体培养基半固体培养基按功能划分选择培养基鉴别培养基(1)按培养基的成分a.合成培养基:

由成分完全已知的化学试剂（各成分包括微量元素的量都确切知道）配制而成特点:成分已知、精确、重复性高、但价格较贵、配制麻烦、且微生物在其中生长速度较慢。如:察氏（Czapek）培养基等。一、培养基b.天然培养基:由天然物质配制而成,成分难以确定,但配制方便,营养丰富。蒸熟的马铃薯----用于培育霉菌普通牛肉汤----用于培育细菌一、培养基c.半合成培养基:

一类主要用已知化学成分的试剂配制，同时又添加某种或某些天然成分的培养基如:马铃薯蔗糖培养基

一、培养基(2)按照培养基形态划分a.固体培养基

在液体培养基中加入2%左右的凝固剂(如:琼脂、明胶等）的固体状态的培养基。用途:常用于微生物的分离、鉴定计数和菌种保存。b.液体培养基不加入凝固剂,成分均匀,微生物可充分接触和利用培养基中的养料,适于生理研究、发酵工业等。固体培养基液体培养基一、培养基c.半固体培养基在液体培养基中加入少量(0.2—0.5%)凝固剂而呈半固体状态。(2)按照培养基形态划分用途:可用于观察细菌的运动、鉴定菌种和测定噬菌体的效价等方面固体培养基半固体培养基液体培养基主要用于微生物的分离、计数等主要用于观察微生物的运动、鉴定菌种等主要用于工业生产需加入凝固剂，如琼脂(3)按照培养基的功能划分a.选择培养基b.鉴别培养基在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其它种类微生物生长的培养基。根据微生物的代谢特点,在培养基加入某种指示剂或化学药品配制而成，用以鉴别不同种类的微生物。选择培养基应用加入青霉素分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐分离金黄色葡萄球菌不加氮源分离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基分离自养型微生物加入青霉素等抗生素分离导入了目的基因的受体细胞

培养基，一般都含有水、碳源、氮源和无机盐等营养物质.

另外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质的需求,例如:生长因子(即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧气等的要求。一、培养基概念来源作用碳源凡是能为微生物提供所需碳元素的营养物质无机碳源

CO2NaHCO3等有机碳源

糖类脂肪酸花生饼石油等①构成细胞物质和一些代谢产物②异养微生物的能源1、微生物的碳源

自养型和异养型微生物分别能利用哪类碳源物质？思考概念来源作用氮源无机氮源

N2、NH4+、

NO3-、NH3等有机氮源尿素、牛肉膏、蛋白胨、氨基酸等凡是能够为微生物提供N元素的营养物质主要用于合成蛋白质、核酸及含N的代谢产物2、微生物的氮源

哪些微生物能够利用分子态氮？氮源能否为微生物提供能量？思考概念成分作用为什么不可缺少？常见的生长因子微生物生长不可缺少的微量有机物有机物酶和核酸的组成成分缺乏合成这些物质所需酶或合成能力有限维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等3、生长因子培养基的配制原则①目的要明确：根据培养的微生物种类、培养的目的等确定培养基的类型和配制量。②营养要协调：培养基中各种营养物质的浓度和比例要适宜。例如：碳氮比4∶1时，谷氨酸棒状杆菌大量繁殖而产生谷氨酸少；碳氮比为3∶1时，菌体繁殖受抑制而谷氨酸合成量大增。③pH要适宜：细菌培养基pH中性或偏碱性，霉菌培养基呈酸性。牛肉膏蛋白胨固体培养基配方牛肉膏5.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g琼脂20.0g将上述物质溶解后，用蒸馏水定容至1000ml。一、培养基根据配方你能配制出100ml培养基吗？配方中的各成分为微生物提供了哪些营养？1、何为无菌技术？无菌技术包括哪些方面？2、消毒和灭菌的区别？3、常用的消毒方法有哪些？4、常用的灭菌方法有哪些？5、干热灭菌法和高压蒸汽灭菌法的操作步骤。二、无菌技术自主学习：对实验操作的空间操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。为避免周围环境中的微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。无菌操作内容消毒使用较温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。灭菌使用强烈的理化因素杀死物体内所有的微生物，包括芽孢和孢子。二、无菌技术（1）日常生活经常用到的是

煮沸

消毒法；（2）对一些不耐高温的液体，则使用

巴氏

消毒法（例如牛奶）；（3）对接种室、接种箱或超净工作台首先喷洒石炭酸或煤酚皂等溶液以增强消毒效果，然后使用

紫外线

进行物理消毒。（4）实验操作者的双手使用酒精进行消毒；（5）饮水水源用氯气进行消毒。消毒的方法常用的消毒方法1、100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3、用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒4、氯气消毒水源5、紫外线消毒……二、无菌技术1、灼烧灭菌2、干热灭菌：160-170℃下加热1-2h。3、高压蒸气灭菌：100kPa、121℃下维持15-30min。常用的灭菌方法二、无菌技术实验原理高压蒸汽灭菌

是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸气,从而使温度高于100℃。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固缓慢。干热灭菌实验原理紫外线灭菌

是用紫外线灯进行杀菌。紫外线杀菌机制主要是它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和DNA链的交联，从而抑制了DNA的复制。波长为200-300nm的紫外线都有杀菌能力，其中以260nm的杀菌力最强。实验原理实验室常用灭菌方法的比较灭菌方法适用对象所需条件灭菌时间灼烧灭菌接种的金属工具(如接种针、接种环)在酒精灯的火焰外焰灼烧直至烧红干热灭菌耐高温需干燥的物品(如玻璃器皿、金属用具)干热灭菌箱内160～170℃1～2h高压灭菌培养基100kPa；121℃15～30minA.培养细菌用的培养基或培养皿B.玻棒、试管、烧瓶和吸管C.接种环、接种针D.实验操作者的双手灭菌灭菌灭菌消毒二、无菌技术消毒与灭菌的区别灭菌方法条件结果常用方法消毒较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物(不包括芽孢和孢子)煮沸消毒法，还有化学药剂(如酒精、氯气、石炭酸等)消毒灭菌强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌实验操作（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基

1、计算：根据牛肉膏蛋白胨培养基配方的比例，计算配制100mL的培养基时，各种成分的用量。2、称量：准确地称取各种成分。牛肉膏比较粘稠，可以用玻绑挑取，放在称量纸上称量。牛肉高和蛋白胨都容易吸潮，称取时动作要迅速，称后及时盖上瓶盖。3.溶化

将称好的牛肉膏连同称量纸一起放入烧杯，加入少量的水，加热。当牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻棒取出称量纸。往烧杯中加入称量好的蛋白胨和氯化钠，用玻棒搅拌，使其溶解。加入琼脂，加热使其熔化。在此过程中，不断搅拌，防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。当琼脂完全熔化后，补加自来水100mL。

4、灭菌

将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压灭菌锅，在压力为100kPa、温度为121℃条件下，灭菌15—30min。将培养皿用几层旧报纸抱紧，5—8套培养基作一包，包好后放入干热灭菌箱内，在160—170℃下灭菌2h。6．无菌检查：将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24—48小时，以检查灭菌是否彻底。5、倒平板

待培养基冷却到50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。倒平板操作1.将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拨出棉塞。1234倒平板技术2.右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰。1234倒平板技术12343.用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基(约10~

20mL)倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖。倒平板技术倒平板技术12344.等待平板冷却凝固，大约需5~10min。然后，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上。1.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？

答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。问题讨论2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？

答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？

答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？

答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。二实验操作二实验操作（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基二实验操作（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基计算称量溶化灭菌倒平板二实验操作（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基称量溶化灭菌倒平板①溶化时为什么要将牛肉膏连同称量纸一起加热?计算二实验操作（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基称量溶化灭菌倒平板①溶化时为什么要将牛肉膏连同称量纸一起加热?可保证粘附在称量纸上的牛肉膏也能溶于水中，减少误差。计算二实验操作（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基称量溶化灭菌倒平板②加琼脂的目的是什么?计算二实验操作（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基称量溶化灭菌倒平板②加琼脂的目的是什么?作为凝固剂计算常用的凝固剂——琼脂主要成分是硫酸半乳聚糖熔点为96℃

凝固点为40℃透明度强。二实验操作（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基称量溶化灭菌倒平板③在灭菌前,用牛皮纸、旧报纸包紧盛有培养基的锥形瓶的目的是什么？计算二实验操作（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基称量溶化灭菌倒平板③在灭菌前,用牛皮纸、旧报纸包紧盛有培养基的锥形瓶的目的是什么？在灭菌时能避免水蒸汽凝结时浸湿棉塞，在取出培养基锥形瓶时也起到隔绝空气中杂菌污染的作用。计算二实验操作（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基称量溶化灭菌倒平板④培养皿能否用高压蒸汽灭菌？计算二实验操作（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基称量溶化灭菌倒平板④培养皿能否用高压蒸汽灭菌？不能，因为培养皿要保持干燥，应该用干热灭菌。计算三、基本操作程序1、器具的灭菌2、培养基的配制3、培养基的灭菌4、倒平板5、微生物接种6、恒温箱中培养7、菌种的保存（一）接种

将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。

接种工具和方法接种和分离工具1．接种针2.接种环3.接种钩4.5.玻璃涂棒6.接种圈7.接种锄8.小解剖刀㈡.纯化大肠杆菌平板划线法和稀释涂布平板法。微生物的接种的常用接种方法有：1.平板划线的操作方法

平板划线法:

通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线的操作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面.

在数次画线后,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落.平板划线法

一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。

一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。问题探讨1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？

操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？以免接种环温度太高，杀死菌种。3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？

划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。稀释涂布平板法

1.将分别盛有9mL水的6支试管灭菌，并按101~106的顺序编号。2.用移液管吸取1mL培养的菌液，注入第二支试管中。用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸三次，使菌液与水充分混匀。3.从101倍稀释的试管中吸取1mL稀释液，注入102倍稀释的试管中，重复第2步的操作。依次类推，直到完成最后一支试管的稀释。注意：移液管需要经过灭菌。操作时，试管口和移液管离火焰1~2cm处.涂布平板操作

涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？

应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等。问题探讨吸取充分均匀后的菌液取含有9mL无菌水之试管，将试管口过火灭菌。将菌液置入，此时试管须做记号为第一次稀释。将试管于震荡机上，使菌液混合均匀取出试管中的第一次十倍稀释菌液1mL，加入另一个新的含9mL无菌水的试管中。重复此步骤直至所需要的稀释浓度。由最后稀释菌液中以玻璃吸管取出0.1mL菌液，置入准备好的无菌琼脂内。將三角玻璃棒浸於酒精中將三角玻璃棒在火焰上燃烧须注意勿使燃烧中的酒精滴入酒精瓶中，引起燃烧）使用玻璃棒将菌液均匀涂布开来，将培养皿置于恒温培养箱中隔天观察菌落数目，再依照稀释倍数推算出菌液浓度。3、微生物的恒温培养3、微生物的恒温培养单个或少数菌体2.特征：大小、形状、光泽度、颜色、透明度等。3.功能：1.定义：菌落鉴定菌种的重要依据固体培养基上大量繁殖子细胞群体四、课题成果评价1、未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有菌落生长，说明了什么？（对照组）没有。若有菌落，说明灭菌不彻底。2、在接种大肠杆菌的培养基上，你是否观察到了独立的菌落？这些菌落的颜色、形状和大小相似吗？是。相似。如在肉汤培养基上，大肠杆菌菌落呈白色，为圆形，光滑有光泽，边缘整齐。

四、课题成果评价3、培养12h和24h后，观察到的实验结果相同吗？如果不同，请分析产生差异的原因。

菌落的大小不同，菌落分布位置相同。原因是时间越长，菌落中细菌繁殖越多，菌落体积越大。4、如果你在培养基上观察到了不同形态的菌落，你能分析出可能是由哪些原因引起的吗？

说明有杂菌污染。可能原因：灭菌不彻底、接种过程或培养过程中有杂菌污染。四、课题成果评价（一）培养基的制作是否合格如果未接种的培养基在恒温箱中保温1～2d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。

（二）接种操作是否符合无菌要求如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。（三）是否进行了及时细致的观察与记录培养12h与24h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。这一步的要求主要是培养学生良好的科学态度与习惯。1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4℃冰箱保存。

2、长期保存：甘油管藏法4、菌种的保存1、下列细菌中，能利用含碳无机物作碳源的是()A光合细菌B根瘤菌C硝化细菌D乳酸菌2、培养大肠杆菌的培养基中，必需含有的碳源和氮源是()A糖、有机酸等B二氧化碳、碳酸盐C蛋白质D无机氮化物ACAC练习3、下列叙述不正确的是()A培养基是为微生物的生长繁殖提供营养的基质B液体培养基和固体培养基所含的最基本物质不相同C微生物在固体培养基上生长时，可以形成肉眼可见的单个细菌BC练习4.获得纯净培养物的关键是（）A将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌B接种纯种细菌C适宜环境条件下培养D防止外来杂菌的入侵D练习5.下列操作与无菌技术无关的是()A接种前用肥皂洗双手,再用酒精擦拭双手B接种前用火焰烧灼接种针C培养在50℃左右时搁置斜面D在酒精灯的火焰旁完成C练习练习6.外科手术器械和罐头食品的处理，要以能够杀死什么为标准()A球菌B杆菌C螺旋菌D芽孢D7.制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的步骤是()A．计算、称量、倒平板、溶化、灭菌B．计算、称量、溶化、倒平板、灭菌C．计算、称量、溶化、灭菌、倒平板D．计算、称量、灭菌、溶化、倒平板C8.下列有关平板划线接种法的操作错误的是（）A．将接种环放在火焰上灼烧B．将已冷却的接种环伸入菌液中蘸取一环液C．蘸取菌液和划线要在火焰旁进行D．划线时要将最后一区的划线与第一区的划线相连D9.产生标准菌落的细菌的最初数目和培养基分别是(

)A．一个细菌，液体培养基B．许多细菌，液体培养基C．一个细菌，固体培养基D．许多细菌，固体培养基C解析：菌落是一个或几个细菌的子细胞群体，在固体培养基上肉眼可见，是作为菌种鉴定的重要依据，若是多种细菌形成的菌落则不是标准菌落。答案：C评析：本题考查菌落的形成和特点，以及在计数中的应用。10.消毒和灭菌是两个不同的概念，灭菌是指彻底杀灭微生物使其永远丧失生长繁殖的能力。消毒仅指杀死一部分对人体有害的病原菌而对被消毒的物体基本无害。下列哪些事物适用于消毒处理 (

)①皮肤②饮用水③牛奶④注射器⑤培养皿⑥接种环⑦培养基⑧果汁⑨酱油⑩手术刀A．①②③⑧