细胞工程第13章 体外单倍体诱导与单倍体育种

体外单倍体诱导与单倍体育种第13章

提要体外诱导方法单倍体育种技术花药培养花粉培养22023/2/16

体外单倍体诱导体外单倍体诱导：通常是指利用离体培养花药或小孢子的方法，诱导形成单倍体植株花粉植株的形态发生：愈伤组织型类胚体型混合型32023/2/16

体外单倍体诱导单倍体育种：将具有单套染色体的单倍体植物，经人工染色体加倍，使其成为纯和二倍体，从中筛选出优良个体，直接繁育成新品种；或选出具有单一优良性状的个体，作为杂交育种的原始材料。42023/2/16

单倍体育种优点：可以控制杂种分离，缩短育种周期；排除显、隐性基因的干扰，提高选择效率；加速自交系育成；进行诱变育种，对栽培品种进行纯化复壮。获得单倍体植物的重要途径：花药、花粉培养52023/2/16植物小孢子发育过程花粉粒形成：初期花药（原表皮和其内的有分裂能力的细胞构成）

四角隅处出现孢原细胞

分裂

四棱形花药

孢原细胞平周分裂

外层周缘细胞+原表皮

花粉囊壁

内层造孢细胞

分裂

花粉母细胞

减数分裂

花粉粒

62023/2/16植物小孢子发育过程72023/2/1682023/2/16植物小孢子发育过程花粉粒的发育

未成熟花粉粒（小孢子）有丝分裂

营养细胞（大）

生殖细胞（纺锤形）分裂

2个精子（雄配子）3-细胞型花粉粒：生殖细胞在花粉粒中进行分裂，成熟花粉有3个细胞2-细胞型花粉粒：生殖细胞在花粉管中进行分裂，成熟花粉只有2个细胞开花时，花粉粒成熟，花药裂开92023/2/16植物小孢子发育过程102023/2/16花药和花粉培养花药培养：将成熟或未成熟的花药从母体植株上取下，在无菌条件下，生长发育的技术。花药再生植株的方式：器官再生胚状体再生胚状体再生特点：两极性与外植体的维管束无直接联系112023/2/16花药和花粉培养花粉培养：把花粉从花药中分离出来，以单个花粉粒作为外植体进行离体培养的技术。裸子植物的花药培养麻黄、银杏、紫杉、榧等被子植物的花药培养悬滴培养法甘蓝、甘蓝芥蓝杂种看护培养法番茄植板培养法水稻、烟草122023/2/16132023/2/16142023/2/16152023/2/16看护培养看护培养（nurseculture）Muir等1953年设计。162023/2/16172023/2/16小孢子母细胞培养小孢子母细胞培养主要用于研究减数分裂和花粉发育182023/2/16花药与花粉培养方法材料的选择材料的预处理培养基接种与再生植株的培育192023/2/16材料的选择1．材料的遗传差异母本材料的遗传背景对花药培养的成败有决定性的影响不同物种之间花药培养的反应存在很大差异同一属内不同种或品种之间也存在诱导性的差异母本材料的基因型是影响花药培养的关键因素一般情况下杂种比纯种容易诱导202023/2/16材料的选择２．母本生理状态的影响母本的生理状态直接影响花药培养早期花蕾花药中花粉生活力高，诱导效果好健壮母本花粉植株诱导率显著高于弱株和衰老株母本的氮素营养水平是另一个重要的影响因素植株长期处于氮饥饿状态有利于提高花粉诱导力花粉母细胞减数分裂时期的光周期、温度、营养状态对小孢子全能性也许会有明显的作用212023/2/16材料的选择3．花粉发育时期第一期四分体时期、第二期单核期（小孢子）第三期双核期和三核期对大多数植物来说，单核中期和晚期是诱导花粉胚或花粉愈伤组织的最佳，尤其是单核靠边期是花粉诱导的关键时期不同植物的花粉对离体培养有其特定的、最敏感的发育时期，大多数植物，单核期的花粉比较容易培养成功222023/2/16材料的预处理常用的预处理方法有：低温处理离心激光照射乙烯利预处理232023/2/16低温处理低温预处理能明显提高花粉胚的诱导率各种材料在进行低温预处理时应保持较高湿度，防止材料失水低温提高花粉诱导率的机制：低温可以改变花粉粒第一次有丝分裂的纺锤体的取向；保持花粉的活力，使其不致在数天内死亡242023/2/16高温处理游离小孢子对高温的预培养敏感期是培养的最初24-48h252023/2/16离心处理离心对花粉诱导的作用机理尚不清楚可能是离心能使花粉孤立化也可能是离心改变了花粉的轴向，有利于花粉的均等分裂262023/2/16激光照射

激光能促进花粉愈伤组织的芽分化乙烯利处理能促使花粉细胞核分裂；能促进花粉愈伤组织得到形成甘露醇处理甘露醇预培养对小麦游离小孢子有促进作用。碳饥饿是启动雄核发育的重要因素272023/2/16培养基基本培养基的组成对花药培养有明显的影响常用的花粉培养基本培养基有MS、Nitsch、B5、BN、MB、N6、H、Miller等。禾本科植物常用N6培养基作为基本培养基杨属较适合的是H培养基比较广泛采用的培养基是MS282023/2/16培养基马铃薯培养基是一种以马铃薯提取物为主要成分的培养基，对小麦、水稻花粉愈伤组织诱导有利改良的马铃薯培养基可用于小麦的花粉愈伤组织诱导和分化292023/2/16培养基碳源蔗糖是常用的碳源，蔗糖的浓度对培养结果有重要影响，较高的浓度有利于提高花粉愈伤组织诱导效率，同时抑制花药体细胞的增殖。不同材料要求的蔗糖浓度差异较大302023/2/16培养基激素大多数植物的花粉必须在含有适当外源激素的培养基上才能诱导出愈伤组织或胚状体在脱分化培养基中，生长素和细胞分裂素的作用非常重要，一般使用较高浓度的生长素和少量的细胞分裂素在分化培养基中，细胞分裂素是主要的诱导激素，一般也配合使用生长素312023/2/16培养基附加成分某些有机附加物对花粉愈伤组织的生长是非常有益的水解酪蛋白、水解乳蛋白、酵母提取物、肌醇等322023/2/16培养基条件培养基利用组织培养物产生分泌物进入培养基，使培养基条件化经过条件化的培养基可以促进培养细胞的分裂和分化332023/2/16接种和再生植株的培养材料的灭菌处理：漂白粉水溶液的上清液浸泡安替福民溶液浸泡升汞浸泡无菌水冲洗超净台取花药、接种342023/2/16接种和再生植株的培养培养条件对大多数植物来说，较高的温度有利于愈伤组织形成。一般温度控制在28-30℃352023/2/16接种和再生植株的培养花粉植株的培育在产生花粉胚的情况下，小植株直接从花药囊中长出来花粉愈伤组织需要在分化培养基和生根培养基上培养，诱导产生芽和不定根362023/2/16接种和再生植株的培养花粉植株的鉴定形态鉴定细胞学鉴定杂交鉴定分子标记鉴定372023/2/16接种和再生植株的培养单倍体植物的染色体加倍常用的是化学诱变法常用的诱变剂有秋水仙素等具体方法：小苗浸泡法生长锥处理法培